羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株VIR基因的比较分析

羊传染性脓疱(Orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的一种人兽共患传染病。VIR是ORFV编码的抗干扰素基因。为比较分析ORFV疫苗弱毒株和野毒株编码的VIR基因的特征,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的VIR基因序列,比较分析了两者核酸水平和氨基酸水平的变异情况以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒VIR基因核苷酸序列相似性为94.6%,氨基酸序列相似性为91.8%,两者在Z-DNA结合结构域和ds-RNA结合结构域均有突变。     

羊口疮病毒疫苗株和野毒株F1L基因的比较分析

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,ORFV F1L基因编码肝素结合蛋白。为比较分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L基因的特征,本试验对疫苗株和野毒株的F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学相关软件及方法,对两者的F1L基因在核酸水平和氨基酸水平的变异情况及其二、三级蛋白结构变化情况进行了比较分析。结果显示,此次测定的ORFV疫苗株与野毒株F1L基因核苷酸序列相似性为95.9%,氨基酸序列相似性为94.5%。本研究结果为揭示ORFV异源宿主致弱的机制积累了资料。     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株GIF基因比较分析

羊传染性脓疱(orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的绵羊和山羊的一种接触性人兽共患病。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/白细胞介素(IL-2)抑制因子(GIF)基因为ORFV编码中晚期病毒基因,它能够与GM-CSF、IL-2结合并且抑制二者的活性,从而抑制宿主抗病毒作用。为了比较疫苗毒株和流行毒株间GIF的差异,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列,比较分析了ORFV疫苗弱毒株和野毒株GIF基因的核酸水平和氨基酸水平的差异情况,以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒GIF基因核苷酸序列相似性为94.3%,氨基酸序列相似性为92.5%,两者的蛋白三级结构预测上也有差异。本研究结果为该病的防控提供了参考依据。     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

羊口疮病毒上海流行株的分离鉴定及其保护性抗原基因遗传进化分析

为了解上海地区羊口疮病毒(ORFV)流行毒株的分子生物学特性与遗传变异情况,采集疑似ORFV感染的羔羊唇部结痂组织,应用PCR、MDBK细胞分离培养、电子显微镜观察、间接免疫荧光技术等方法,进行分离鉴定,并对这2个分离毒株保护性抗原基因F1L、B2L进行克隆与序列分析。结果表明,成功分离到2株ORFV,将其分别命名为ORFV-F416、ORFV-F429。其中,2株分离株F1L基因与参考毒株核苷酸序列同源性分别为95.2%~99.4%,推导氨基酸序列与参考毒株氨基酸序列同源性分别为94.4%~99.4%,遗传进化树分析均显示2株均属于同一分支,且与福建株FJ-YX(KC568410)亲缘关系最近。但与相关参考毒株相比,分离株FIL基因编码的氨基酸在44~66位不存在核苷酸的缺失,表明上海流行株与FJ-YX株存在一定的变异。2株分离株B2L基因与参考毒株核苷酸序列同源性为96.7%~99.6%,氨基酸序列同源性为94.7%~98.9%,且在遗传进化树上均与广西株GX-YB(JQ904793)有较近的亲缘关系,但与中国疫苗株(JQ904789)亲缘关系较远。表明从上海地区分离得到的2个毒株与流行于中国南方地区的ORFV毒株有较近的亲缘关系,但分离株的FIL基因和B2L基因存在一定变异。     

河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析

为监测和探究河南省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行株变异情况,本试验对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及全序列测定,与河南省2011-2013年流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析,并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0%~99.8%,氨基酸同源性为97.0%~99.5%;与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1%~99.0%,氨基酸同源性为97.2%~98.8%,与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%~99.0%,氨基酸同源性为91.9%~99.0%;与经典毒株相比,S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性为91.7%~93.6%,氨基酸同源性为92.0%~93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的2个群,流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异,与2010年暴发时相比存在部分突变,毒株之间存在部分差异,研制出有效的针对流行毒的疫苗依然是目前防控该病的重中之重。     

济南市犬瘟热病毒H基因遗传进化分析

为了解济南市犬瘟热病毒(CDV)的流行情况,通过随机采集7份济南市2019年1月-6月份宠物医院疑似感染CDV的临床样品,提取病毒RNA,扩增CDV H基因全长序列,连接至载体,测序后进行H基因序列的氨基酸及核苷酸同源性分析、进化树分析、主要氨基酸位点突变分析以及H基因抗原表位预测分析。结果显示,7个野毒株均为Asia-Ⅰ型,H基因核苷酸同源性为98.7%～99.9%,氨基酸同源性为98.7%～100%,与疫苗株相比差异较大,核苷酸、氨基酸同源性分别为90.0%～90.9%和88.8%～91.4%。主要氨基酸位点突变分析表明,除SD-07为8个潜在天冬酰胺糖基化位点,其余6株均为9个潜在天冬酰胺糖基化位点。H基因抗原性预测分析表明,7个野毒株与疫苗株相比存在明显的差异。研究结果表明,济南市犬瘟热病毒株以Asia-Ⅰ型为主,野毒株同源性与疫苗株相比差异较大,不同毒株间存在遗传多样性。     

山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离鉴定及TK基因遗传变异分析

为了解当前山东省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)流行特点,本研究对2018年来自山东省不同地区的10份伪狂犬疑似病料进行PRV的分离鉴定,并对分离株的TK基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果表明,共分离到7株PRV,其TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.1%～99.8%和98.7%～99.4%,与参考毒株TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.8%～99.9%和97.2%～99.7%,而且7株分离株与国内报道的PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。对TK基因的核苷酸序列分析发现,与欧美参考株相比,分离株和国内变异株在其碱基第644-645位由AC突变为GT,导致其氨基酸第215位由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)。TK基因的遗传进化树分析结果表明,本研究中7株分离株分别与国内之前报道的JS-2012、He N1、TJ以及ZMD2012等变异株位于两个相对独立的分支上,亲缘关系较近,而都与NIA3、Becker等欧美毒株以及疫苗株Kaplan(Bartha-K61株)的遗传距离较远。结果表明,本研究所得7株分离株均应属于PRV变异毒株。     

10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的10株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的10株病毒的HA和NA基因变异程度不大,变异概率大;在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类CBJ194亚分支,与CBJ194的HA基因核苷酸同源性在88.8%~95.8%,NA基因核苷酸同源性在93.4%~97.6%,可能与CBJ194由同一毒株进化而来。由于基因突变使ACHB101毒株的HA基因出现了新的糖基化位点,ACHN102毒株的保守受体结合位点发生变异。NA基因推导氨基酸序列中第63、64、65位有T、EI、3个氨基酸的缺失,导致61位糖基化位点的丢失。唾液酸吸附位点上有明显的突变。HA和NA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

鸡传染性支气管炎病毒KIBVXJ株S1基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因,设计并合成了一对引物,经RT-PCR扩增后获得全长约为1700bp的核苷酸序列。序列分析表明,S1基因的最大开放阅读框位于12位～1685位碱基之间,编码557个氨基酸;KIBVXJ株S1基因序列在19位～292位点的氨基酸区域内有较多的氨基酸置换、插入和与缺失现象;S1的裂解位点的序列为HRRRR,具有我国地方流行株的特征。KIBVXJ株的S1基因与国内外疫苗株的同源性分析表明,核苷酸同源率为73.8%～74.2%,氨基酸同源率为74.9%～76.0%。遗传进化分析表明,KIBVXJ株与国内外的主要疫苗株亲缘关系最远,与国内近年来分离的A2株、LX4株和QXIBV株的亲缘关系最近。     

青海省刚察县羊口疮病毒的分离与鉴定

利用MDBK细胞从青海省刚察县某藏羊养殖小区发病羊唇部痂皮中分离获得一株病毒,通过临床症状、PCR检测以及组织病理学观察等方法对该株病毒进行了鉴定,证实分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf Virus,ORFV),命名为ORFV-QHGC01。参照Gen Bank中ORFV F1L基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,对ORFV-QHGC01株F1L基因进行了克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与Genbank中AF097215、AY040081、AY040082、AY040083、AY040084、AY040085、FJ808075、HQ221964、JQ271535株的核苷酸序列同源性分别为:96.7%,95.6%,96.1%,96.2%,97.5%,97.2%,96.5%,95.3%,98.3%。系统发育进化树结果表明,ORFV-QHMH01分离株与参考毒株JQ271535的亲缘关系较近,这表明不同地区分离株的F1L基因具有较好的保守性。     

2006－2016年中国羊口疮病毒的遗传演化分析

羊口疮（Orf disease）是由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的人兽共患传染病,该病广泛分布于世界各地,对公共卫生造成了严重的影响。为了解中国ORFV毒株的起源、分子流行病学及病毒系统研究的信息,本研究对中国2006-2016年分离到82株ORFV毒株进行了系统的遗传演化分析,利用DNAStar和Mega 5.0软件对ORFV011（B2L）、ORFV020（VIR）、ORFV059（FIL）和ORFV127（vIL-10）基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并在此基础上构建系统发育树。结果显示,82株病毒B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为95.9%~100%和86.5%~100%,F1L基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.5%~100%和94.0%~100%;系统进化分析显示,中国不同地方分离的ORFV毒株处于不同分支上,甚至同一个省内的毒株也分布在不同分支上。表明中国ORFV毒株进化特殊,处于不同的进化分支上,且有发生突变的可能性,世界各地流行的代表性毒株在中国均有变种分布,这增加了中国防控ORFV的难度。本研究结果为中国防控羊口疮的流行和研制高效疫苗提供了基础数据。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（porcine pesudorabies virus,PRV）gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

区分犬瘟热病毒Asia-Ⅰ型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

犬瘟热是一种接触性传染病,可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,导致全身性的病理变化,对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁。目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染。为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法,本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序,从氨基酸水平和碱基水平比对分析后,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。通过对H基因进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗株Y2为America-I型,疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型。对比179株Asia-Ⅰ型（6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型）与3株疫苗株的CDV-H基因序列,采用AS-PCR技术（3'端错配）设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物,上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3',下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'。结果显示该引物有较强的特异性,6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段,疫苗株不能扩增,且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基（氨基酸）变异位点,而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺,这些变异可能导致N-糖基化位点的增加,从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响。本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株。     

The Establishment of AS-PCR Method to Distinguish Canine Distemper Asia-I Type Wild Strains and Vaccine Strains

Canine distemper (CD) is a contagious disease, which can damage the immune system, respiratory system, digestive system, and even nervous system, leading to systemic pathological changes, and has a huge threat to pet dogs, fur animals, etc. At present, the commonly used colloidal gold test cannot effectively distinguish vaccine immunity from animal natural infection. To establish an efficient and accurate detection method for identifying wild strains and vaccine strains of canine distemper virus(CDV), the whole genome of six canine distemper wild strains isolated from dogs and three widely used CDV vaccine strains collected from Wuhan area were sequenced. After comparing and analyzing the amino acid and the base sequences, the H gene was determined as the target gene for AS-PCR primer design. By genotyping the H gene, it was found that the prevalent CDVs in Wuhan were all Asia-Ⅰ, while the vaccine strain Y2 was America-I, and the vaccine strains Y1 and Y3 were both America-Ⅱ. Comparing the CDV-H gene sequences of 179 Asia-Ⅰtypes (6 wild-type strain samples + 173 GenBank Asia-Ⅰtype stains) and 3 vaccine strains, using AS-PCR technology (3'mismatch) to design a pair of primers. It can effectively distinguish CDV Asia-I wild strain and vaccine strain. The upstream primer sequence is 5'-TTAATATAATAATGACAGTG-3', and the downstream primer sequence is 5'-CCTCAAGGGGCACA-3'. The results showed that the primer had a strong specificity and the wild strains could amplify an 894 bp fragment, while the vaccine strains could not. There are 9 more regular bases (amino acids) variation sites in H gene of wild strain, and the 277th amino acids of all vaccine strains are Asparagine. These mutations may lead to an increase in N-glycosylation sites, which will have an impact on the virulence of canine distemper virus vaccine strains. The AS-PCR method established in this study can effectively distinguish the canine distemper vaccine and Asia-Ⅰwild strains.