蛋鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因遗传进化分析

为了解福建省蛋鸡J亚型禽白血病病毒(ALV-J)的遗传进化关系,对来自福建省蛋鸡场发病蛋鸡中分离鉴定的3株ALV-J的gp85基因进行克隆与测序,并与国内外18株ALV-J参考株的基因序列进行分析。结果表明:3株蛋鸡分离株的gp85基因与亚群2的国内蛋鸡分离株(CL09DP02、GL09DP01和HuB09JY03)以及原型株HPRS-103的亲缘关系较近,达97.8%~99.6%,表明福建省蛋鸡ALV-J株很可能与国内部分蛋鸡ALV-J分离株有着共同的来源。     

鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒二重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上已发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)NS5基因序列和产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列,分别设计了检测DTMUV和EDSV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为242 bp和181 bp。通过退火温度及引物浓度的优化,建立了针对这两种病毒的二重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过检测两种病毒感染的阳性病料各10份,结果显示,该二重PCR检测方法对阳性样品的检出率可达100%。这表明该方法可以用于鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的检测。     

禽呼肠孤病毒RT—LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠孤病毒（Aviem reovirus,ARV）S1基因序列设计了特异对应靶序列中的6个基因区段的4条引物,以此建立了一种快速、准确的ARV逆转录环介导等温扩增（RT—LAMP）检测方法,并对此方法的反应条件进行了优化。结果表明,该方法能够特异地扩增ARV,而对其他常见的禽类病毒均无扩增作用,特异性强、重复性好;检测ARV的灵敏度为4ELD50,是RT-PCR方法的10倍;在反应产物中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。     

番鸭细小病毒弱毒疫苗的研究

应用生物技术从番鸭细小病毒菁田株（ＭｕｓｏｖｙＤｕｌｋｉｌｉｎｇＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＭＰＶ－Ｐ）选育出对１日龄雏番鸭无致病力的弱毒疫苗株（ＭＰＶ－Ｐ１）。该弱毒株具有良好的兔原性和遗传稳定性；制备成疫苗，免疫注射１日龄雏番鸭，免疫后３ｄ部分鸭血清中出现抗体，７ｄ９８％以上的鸭血清中出现抗体；２１－３０ｄ抗体效价达高峰，有效免疫期在１９０ｄ以上；注苗后７ｄ攻毒，保护率１００％；当ＬＰＡＩ滴度在ｌｏ     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究

为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法 ,筛选细胞浓度、刀豆蛋白ConA浓度和培养时间 3个参数对试验条件进行了研究。结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件 ,细胞浓度 5× 1 0 6个 /mL在 2 0 μg/mLConA的RMPI 1 640完全培养基 40℃培养 60h。试验表明 ,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测     

番鸭呼肠孤病毒MW97106C蛋白基因克隆及其在E．coli中表达

应用RT～PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因，序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp．编码269个氨基酸，相对分子量为29．4ku，DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93％的同源性，而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21％～25％之间，表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中．经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，Western—blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应．表明σC基因表达产物具有免疫原性，为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒生化及基因组特性的比较

番鸭细小病毒莆田株（MPV-P）和鹅细小病毒莆田株（GPV-P）分别感染的番鸭胚尿囊液经氯仿处理、PEG沉淀和Sepharose4B柱纯化。纯化样品在电镜下观察，均见到实心和空心2种病毒粒子。病毒粒子呈圆形，立体对称，无囊膜，直径为20-24nm。经SDS-PAGE分析，MPV和GPV均呈现3条结构蛋白带。MPV结构蛋白的相对分子质量约为VP1 89000、VP2 78000和VP3 61000，其中VP3为主要结构蛋白。GPV要相对分子质量与MPV有微小差别。MPV和GPV核酸均为单链DNA，长度约为51000bp。分别以MPV核酸和GPV核酸为模板，加到无引物的DNA聚合酶Ⅰ大片段合成体系中，合成产物经1%琼脂糖凝胶电泳，均可见长度约为5600bp的双链DNA带，证明MPV和GPV核酸的3'末端具有发夹结构。对这2种病毒核酸及经Klenow合成的双链核酸进行限制性内切酶分析，两者的酶切结果明显不同，表明MPV和GPV核酸在一级结构上存在明显差异。以上结果证明，MPV和GPV不但在致病性上有显著养异，而且在核酸结构上也有明显差异。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒二联弱毒细胞苗的研究

应用适应于番鸭胚成纤维细胞(MDEFC)上繁殖,并产生细胞病变的鹅细小病毒(GPV)弱毒疫苗株与番鸭细小病毒(MPV)弱毒疫苗,按适当比例混合,试制了MPV-GPV二联弱毒细胞苗,并测定了各项免疫指标.结果显示试制出的二联苗对1日龄雏番鸭具有良好的安全性和遗传稳定性;免疫后5 d和7 d攻击GPV强毒,保护率分别为75%和100%,同时免疫后7 d血清中MPV-胶乳凝集抑制(LPAI)抗体效价均大于21,21～28 d抗体达高峰,有效免疫期超过60 d.疫苗于-20℃保存期大于12个月.上述结果表明,二联弱毒细胞苗安全有效.     

番鸭呼肠孤病毒病雏番鸭实质器官的超微结构

对人工感染番鸭呼肠孤病毒发病雏番鸭的心、肝、肺、肾、脾脏、胸腺、法氏囊等7种实质器官的超微结构进行了观察。电镜下发现：心、肝、肺、肾等实质器官出现不同程度的细胞变性、水肿以及局灶性溶解坏死；各器官血管内皮细胞脂滴增多、水肿以至坏死脱落．通透性增加；浆细胞、淋巴细胞和吞噬细胞呈散在或灶性浸润于坏死区和实质细胞间。免疫器官脾脏、胸腺和法氏囊中的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋亡，且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增生的吞噬细胞所吞噬，淋巴细胞数量明显减少。上述结果提示，番鸭呼肠孤病毒能导致番鸭免疫抑制。