猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(CSFV)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:CSFV-E0和CSFV-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。     

高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明：该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。     

浅谈奶牛产后瘫痪的预防和治疗

本病常见于高产奶牛，特别是３－６胎次多发。目前对其病因尚未定论，但与其血钙，血磷浓度有关。１病因：１．１分娩后开始泌乳，大量的钙质从乳汁中排出，使血钙含量急剧下降。１．２分娩前后，由于胃肠道消化机能减弱，分娩时雌激素升高，致使钙的吸收率降低。１．３甲状旁腺机能减退，血钙调节失调。１．４血磷含量降低。２症状２．１初期病牛表现兴奋不安，对刺激敏感，不让触摸，站立不稳定，后躯摇摆。２．２中期随时趴地，嗜唾，肌肉松弛，体温低。２．３末期常侧卧或伏卧、昏迷、迟钝、瞳孔散大，脉搏微弱，心率增快。３诊断：３．…     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析

[目的]鉴定由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭（编号为HN/XT）发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

猪圆环病毒2型的全基因克隆和序列分析

参考GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因序列,设计一对PCR引物,从病料中扩增获得4株PCV-2的全基因组序列,分别命名为SDNY-PCV-2、ShD-PCV-2、HBbd-PCV-2、GSLN-PCV-2,经测序确定长度均为1 767 bp。应用DNA Star序列分析表明,4个PCV-2分离株与国外部分分离株的核苷酸序列同源性达95.5%~99.8%,与PCV-1毒株的序列同源性为76.2%~77.6%。与国内外部分分离毒株序列进化树分析表明,4个PCV-2分离毒株处于不同分支中,存在一定差异。     

2株猪圆环病毒2型ORF2的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核酸序列,设计一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得重组质粒pMD18T-ORF2。序列分析表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2ORF2的分离株的同源性在91.5%～99.4%,与杭州分离株的同源性达到99.4%,表明我国各地区之间PCV-2的分离株存在较大的差异。     

猪水疱病自杀性DNA疫苗的初步研究

利用RT—PCR技术，用保真酶扩增获得猪水疱病病毒外壳蛋白1BCD基因，克隆于DNA复制子载体pSCAl中，获得重组质粒pSCA／1BCD。将重组质粒转染BHK-21细胞，RT-PCR法和间接免疫荧光法检测显示，猪水疱病病毒外壳蛋白基因在转染细胞中表达。豚鼠免疫试验表明，自杀性DNA疫苗pSCA／1BCD可诱导SVDV特异性抗体和T淋巴细胞增殖。     

可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中.