番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT—PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因，将其克隆到pFastBacHTA载体上，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC；将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR筛选，获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-σc；SDS—PAGE和Western—blot分析表明，在sf-9细胞中表达了分子质量约37ku的σC蛋白，该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应，这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒p10.8蛋白致细胞凋亡功能

为确定番鸭呼肠孤病毒(DRV)p10.8蛋白的生物学功能,本研究采用RT-PCR方法扩增DRV S14株p10.8编码基因,将其克隆到真核表达载体中,构建了重组表达质粒pcDNA-p10.8;通过转染鸭胚成纤维细胞(DEF),首次对p10.8蛋白的凋亡功能进行了研究.细胞转染48 h后,Hoechest、DNA Ladder和TUNEL法的细胞凋亡检测结果显示:光镜下可见细胞形态学上出现的细胞皱缩,Hoecheg染色后可见细胞核固缩,染色质凝固成团块状;DNA Ladder法可检测到凋亡细胞DNA样品呈梯形条带;TUNEL法可观察到褐色调亡细胞的存在.以上结果均表明,p10.8在DEF中的表达具有诱导宿主细胞凋亡的作用,是番DRV的凋亡蛋白.     

猪、鸡与貂源肠外致病性大肠杆菌群型、耐药性与致病性分析

为检测不同动物源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的耐药及致病性差异,本研究从132份鸡、猪和水貂等动物肠道外组织中分离鉴定大肠杆菌,并对分离菌株进行了16S rRNA基因测序、毒力基因检测、药敏试验、O抗原鉴定、系统进化群分析及动物致病性试验。实验结果显示:分离出53株ExPEC,且至少携带特异性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTII中的两种基因,并携带fimH、ibeA、hlyA、malX、iss、iroN等其它相关毒力基因。53株ExPEC分离株对氯霉素、卡那霉素、头孢噻吩、四环素、多粘菌素B、氨苄青霉素等呈现不同程度的多重耐药性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78、O120血清型;系统进化群分析结果显示:28株属于A群,19株属于B1群,1株为B2群,5株属于D群。选取20株ExPEC分离菌株按照6×10~6cfu/只对小鼠进行腹腔注射,验证其致病性;并测定ExPEC6、ExPEC42、ExPEC52、ExPEC53菌株对BALB/c小鼠的LD_(50),其结果分别为3.49×10~6cfu/mL、9.49×10~5cfu/mL、9.48×10~6cfu/mL、2.38×10~7cfu/mL。本研究为动物源性ExPEC的预防诊断提供依据,并为下一步研究其致病机理等奠定基础。     

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法.该方法对Kss、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性.本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法.用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性.     

抗鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗鸭多杀性巴氏杆菌(P.multocida)外膜蛋白H(OmpH)单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的OmpH重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并以重组OmpH蛋白为抗原,通过间接ELISA方法筛选出3株能够稳定分泌抗OmpH的杂交瘤细胞株(1A9、1E9、3G7)。MAb亚类鉴定表明,1A9、1E9和3G7均为IgG1亚类,轻链均为κ链。经western blot和间接免疫荧光检测证明3株MAb均具有良好的特异性。这些抗OmpH MAb的获得,为鸭P.multocida病的快速、有效、敏感的诊断方法建立奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

某种猪场猪疥螨感染情况调查及治疗试验

采用显微镜直接检查法和虫体浓集法,对河南某种猪场的保育猪、育肥猪和种母猪疥螨感染情况进行了调查,结果其感染率分别为55.0%、67.2%和40.0%,平均感染率为58.82%。分别应用1%伊力佳、阿力佳注射剂按0.3 m g/kg体重1次皮下注射,或预混剂按1.5 kg/t料混饲连喂1周或2周、或按2 kg/t料混饲连喂1周对疥螨病猪进行治疗,用药后15 d,螨虫转阴率均达100%,平均病变记分减少率为84.83%(81.6%~88.4%),表明上述2种药物不同剂型和用法、用量对猪疥螨病均具有良好疗效。建议规模化猪场使用1%阿力佳预混剂,按1.5 kg/t料,混饲连喂1~2周防治猪疥螨病。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

黑龙江省一起牛曼氏杆菌病疫情的暴发调查

2015年11月14日至12月14日,黑龙江省某县多个村从外县购入的牛发生不明原因的急性死亡。发病牛主要表现呼吸道症状,从发病到死亡的时间为几小时到数天不等,病死牛剖检可见严重肺炎病变。为揭示疫病暴发的主要病因,提供防控建议,结合现场流行病学调查和实验室诊断,对该次疫情开展了调查。调查结果显示:此次疫情波及6个村,发病牛多为1岁左右;时值气候寒冷;疫情发生前1周左右,有牛调运史。实验室诊断结果显示,采集的样本中均含有未分类的曼氏杆菌,其对氨苄西林和环丙沙星耐药,而对头孢曲松敏感。最终确认本次疫情是由牛群调运、寒冷气候和年龄等风险因素相互作用,诱发曼氏杆菌的内源性感染所致。