猪链球菌7型强弱毒株SBP_bac_5差异表达蛋白的鉴定

前期研究表明细菌胞外溶质结合蛋白家族5 (SBP_ bac_5)基因在猪链球菌7型(S.suis 7)型强毒株WC0711中表达量高于弱毒株M13中,推测SBP_ bac_5为S.suis7型强弱毒株差异性表达蛋白.为进一步证实该结果,本研究采用real-time RT-PCR技术在基因水平检测S.suis7型强弱毒株中SBP bac_5 mRNA的表达量差异,结果显示,强毒株WC0711中SBP bac 5的mRNA表达量为在弱毒株M13中的4.59倍.将SBP bac 5的PCR产物克隆于pET-30a中,通过E.coli BL21诱导表达,纯化后的蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清检测S.suis强弱病毒株中SBP bac 5的表达量差异.结果显示,重组蛋白获得高效表达,S.suis 7型强毒株WC0711中SBP bac 5表达量是弱毒株M13的3.8倍.     

通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAV_(FDDV12)体内复制的影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。     

慢病毒跨膜蛋白的研究进展

在慢病毒感染过程中,基因和抗原性变异的基本特征已被世界科学家所认同,虽然未被证实,但慢病毒的抗原多样性对慢病毒疫莆的研究是一个主要障碍.慢病毒的抗原变异主要是指病毒的囊膜蛋白(Env)发生改变.     

猪、鸡与貂源肠外致病性大肠杆菌群型、耐药性与致病性分析

为检测不同动物源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的耐药及致病性差异,本研究从132份鸡、猪和水貂等动物肠道外组织中分离鉴定大肠杆菌,并对分离菌株进行了16S rRNA基因测序、毒力基因检测、药敏试验、O抗原鉴定、系统进化群分析及动物致病性试验。实验结果显示:分离出53株ExPEC,且至少携带特异性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTII中的两种基因,并携带fimH、ibeA、hlyA、malX、iss、iroN等其它相关毒力基因。53株ExPEC分离株对氯霉素、卡那霉素、头孢噻吩、四环素、多粘菌素B、氨苄青霉素等呈现不同程度的多重耐药性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78、O120血清型;系统进化群分析结果显示:28株属于A群,19株属于B1群,1株为B2群,5株属于D群。选取20株ExPEC分离菌株按照6×10~6cfu/只对小鼠进行腹腔注射,验证其致病性;并测定ExPEC6、ExPEC42、ExPEC52、ExPEC53菌株对BALB/c小鼠的LD_(50),其结果分别为3.49×10~6cfu/mL、9.49×10~5cfu/mL、9.48×10~6cfu/mL、2.38×10~7cfu/mL。本研究为动物源性ExPEC的预防诊断提供依据,并为下一步研究其致病机理等奠定基础。     

猪链球菌对红霉素耐药性的研究

从发病猪体内分离、鉴定猪链球菌，采用肉汤稀释法和纸片琼脂扩散法筛选对红霉素耐药的猪链球菌，用双纸片法确定耐药株的耐药表型，通过聚合酶链反应检测对红霉素耐药的基因ermb/mefA。猪链球菌对红霉素的耐药表型为cMLS表型，即同时对克林霉素耐药。在3株红霉素耐药株中扩增到ermb基因，其余未能检测到ermb或mefA基因。     

大环内酯类药物对链球菌耐药性及耐药机制

链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便、鼻咽部、泌尿生殖道，致病性链球菌可引起多种动物和人的化脓性炎症。尤其是肺炎链球菌和猪链球菌对大环内酯类药物的耐药性日趋严重，给疾病的诊断和治疗带来困难，对人类公共卫生造成危害。现将大环内酯类药物对链球菌耐药性及耐药机制作以阐述，为预防疾病提供依据。     

牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定

为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件.结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1％甲醇浓度诱导,诱导72 h.上清中目的蛋白表达量最高可达200 μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础.     

不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究

为研究不同毒力的PRRSV对仔猪肺脏和外周免疫器官损伤的差异,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4株)和PRRSV经典株(CH-1a株)感染35日龄健康的断奶仔猪,并在感染后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d各迫杀3头,检测肺、颌下淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏的病毒载量及病理变化情况,同时检测血清中抗PRRSV的抗体水平。结果表明:感染后3 d肺脏及各免疫器官可检测到病毒,HuN4感染组病毒载量比CH-1a感染组病毒载量高1 000倍;HuN4感染组病毒载量峰值出现在感染后10 d,而CH-1a感染组维持着较低水平的病毒载量。组织病理学检测显示HuN4感染组淋巴结内淋巴细胞显著减少,呈空泡状;CH-1a感染组淋巴结内淋巴细胞轻度减少,呈星隙状。本实验表明HuN4株比CH-1a株对肺和外周免疫器官造成更严重的损伤。     

马传染性贫血弱毒疫苗株致弱过程中表面蛋白gp90的进化分析

为进一步研究马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机制,本实验对EIAV弱毒疫苗的原始种毒EIAVLN40、亲本病毒株EIAVDV、驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121和EIAVDV减毒过程中的3个中间代次病毒(EIAVDLV32、EIAVDLV62和EIAVDLV92)的gp90基因进行测序分析。结果显示,适应白细胞培养的病毒株的进化距离更接近,与亲本病毒株处于进化树的不同分支。与强毒株相比,适应白细胞培养的病毒株在9个位点发生优势氨基酸的转换和V3区糖基化位点191NSSN194的缺失。此外,伴随EIAV毒力减弱的过程,有8个位点出现优势氨基酸残基的转换,在各代次病毒株中V4区具有糖基化位点237NNTW240和246NETW249的克隆所占的比例逐渐降低,其中EIAVDLV121的糖基化位点237NNTW240完全缺失。     

猪源凋亡相关基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立

为检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的猪胸腺中凋亡相关因子的变化,本研究针对猪TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因及内参β-actin基因设计特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因的SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法.结果显示,该方法线性关系好(R2≥0.998),敏感性高,初始模板的检出下限为10拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,批内、批间重复试验的变异系数均小于3％,具有良好的重复性.本研究为细胞凋亡相关因子变化趋势的研究提供方法.