猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3(cz)株ORF5基因序列分析及原核表达

从河北沧州分离到1株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株.根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N 端28个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应.为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。     

PRRSV SD-1株ORF7基因的克隆、测序及原核表达载体的构建

参照PRRSV ATCC VR2332株基因序列设计1对引物P1、P2,经RT-PCR扩增出PRRSV SD-1株ORF7基因,经与PMD18-T Vector连接后筛选出阳性克隆株测序。把PRRSV SD-1株ORF7 cDNA亚克隆到PQE上构建PQE-N原核重组表达载体。结果表明,PRRSV SD-1株ORF7核甘酸序列与PRRSV ATCC VR2332株ORF7核甘酸序列完全一致,与欧洲株LV符合率为58%。成功构建原核表达载体PQE-N,为N蛋白的研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF3基因的克隆及变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF3基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP3进行序列测定与分析。应用DNA Star软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株的ORF3基因进行序列比较,并绘制系统进化树。这为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株GF1107株ORF7基因的克隆与表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因的核苷酸序列，设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增PRRSV GF 1107株（GenBank登陆号：AY684124）的ORF7片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中获得含有相应片段的重组质粒pMDHB-ORF7。对质粒中的插入片段进行测序，应用DNAstar序列分析软件对所测序列与GenBank中PRRSV毒株进行同源性比较。将0RF7基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）中，在IPTG的诱导下成功获得表达，经Western blotting分析表明。表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应，为PRRSV新型诊断试剂的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

PRRSV tGP5基因克隆及pcDNA3.1-tGP5真核表达载体的构建

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF5基因的核苷酸序列设计一对特异性引物,用PCR扩增PRRSV GP5蛋白非中和性表位缺失的tGP5基因,将基因定向连接在真核表达载体pcDNA3.1的HindⅢ和EcoRⅠ多克隆位点之间,构建重组质粒pcDNA3.1-tGP5。转化DH5α感受态大肠埃希菌,提取质粒。重组质粒经PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定,成功构建了pcDNA3.1-tGP5基因的重组体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的克隆及其表达载体的构建

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的表达,研究参照GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株(PRRSV Guizhou-1)的核苷酸序列,利用DNASTAR、Oligo6.0和Primer Premier 5.0软件设计1对ORF5基因的特异性引物,同时将贵州大学动物科学学院分子生物学实验室分离、保存的PRRSV Guizhou-1接种于Marc-145细胞,产生明显细胞病变后收集病毒,用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR扩增后获得目的基因,并将其克隆于质粒pMD18-T载体后转入大肠杆菌Top10细胞中,然后分别克隆于原核表达载体pET-32a(+)和真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,再进行抗性筛选、酶切鉴定和序列测定.结果表明:得到含有目的基因的阳性克隆,成功构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因原核表达载体pET-ORF5及真核表达载体pcDNA-ORF5.     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列，分别设计一对引物，应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段，进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定，同时对插入序列进行测序分析，表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％，pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建，为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SGQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BD株的分离及GP4基因的克隆

从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株.根据GenBank公布的PRRSV JXA1株0RF4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF4基因,将扩增产物连接到pMD19-T 载体并转化克...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

PRRSV NC株ORF3基因的克隆、序列分析及表达

为原核表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF3基因,本研究根据GenBank登录PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 6.0软件设计合成一对特异性引物,经RT-PCR扩增得到了大小为765bp的片段。将扩增的ORF3基因截短为495bp和750bp片段分别克隆于原核表达载体pGEX-KG中,在IPTG的诱导下进行Gp3重组蛋白的截短表达,经western blot检测证实表达的2种截短重组蛋白均具有良好的与抗体的反应活性,从而为进一步研制新型疫苗提供了实验依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析

为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5（GP5）的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株（GenBank登录号：HQ701732.1）RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5（ORF5）基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号肽和跨膜功能区的2段基因片段。利用酶切位点,将2段基因连接到原核表达载体pET-28a（+）上,获得重组表达质粒pET28a-GP5。将重组质粒导入BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得表达。经Western blotting鉴定,重组蛋白可被PRRSV阳性血清识别。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测,小鼠能产生针对蛋白的血清抗体。因此,该重组PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究GP5蛋白的结构和功能奠定基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法从河南分离的1株（HN6）猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5（deleting ORF5），并将其克隆到pMD18-T载体中测序，再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用不同浓度IPTG分别于37℃诱导，经SDS—PAGE分析，所表达的融合蛋白的分子质量约31．4ku，薄层扫描分析显示，表达量占菌体总蛋白含量的28．8％。Western—blotting结果表明，重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实，该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析

参照GenBank中所收录的猪轮状病毒OSU株序列设计了一对特异性引物,RT—PCR扩增出1062bp的vp7全长基因,与参考OSU序列的核苷酸同源性达99．8％,克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T—vp7阳性质粒。以阳性质粒为模板,利用引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增得到含有vP7中和抗原表位区域639bp的基因片段,定向克隆到表达载体pGEX-6P—1中,经酶切PCR鉴定的阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（终浓度为1．0mmol／mL）37℃诱导4h后,SDS—PAGE电泳显示表达了大小约50ku带GST标签的融合蛋白,薄层扫描显示蛋白表达融合量占菌体总蛋白的33．2％。Westernblot分析表明该VP7重组蛋白可与PRV阳性血清特异性反应。     

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。