猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HuN4株的N基因克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了重组His-N蛋白,蛋白分子量为14 kDa,能被PRRSV阳性血清特异性识别。经超声裂解和SDS-PAGE检测后,重组蛋白主要以可溶性形式表达。随后利用磁珠纯化重组蛋白,采用背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后获得多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光检测结果表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应活性,能够与真核表达或病毒的N蛋白发生特异性反应。     

高致病性PRRSV HuN4株Nsp4的原核表达及其抗体水平检测

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp4的免疫学特性,本研究根据PRRSV HuN4株序列,设计并合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp4基因的引物。将扩增产物与原核表达载体pGEX-6P-1连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。Western blot试验显示,Nsp4在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并且具有良好的反应活性。利用该蛋白建立ELISA方法,检测PRRSV HuN4株感染仔猪的不同时间内的血清,并比较抗Nsp4,囊膜蛋白和M蛋白,N蛋白的抗体水平,结果表明Nsp4抗体升高的时间晚于囊膜蛋白和M蛋白、N蛋白出现的时间,同时抗体水平也低于其他蛋白。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备方法

研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体(Mabs)的制备方法.本研究以HP-PRRSV为研究对象,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加BamHI和SalI酶切位点,获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接,转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后,取细菌菌体用SDS-PAGE分析.结果表明,Nsp2在大肠杆菌中得到表达.经包涵体的提取,用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt鉴定,结果表明,融合表达的pET28a-dNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别.取纯化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠.取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,采用有限稀释法进行克隆.经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A2F1.Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应,而不与PRRSV CH1A株发生反应,证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb.抗体亚类鉴定结果表明,重链为IgG1型,轻链为κ链.采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1:800,腹水效价分别为1:12800.这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白鼠源多克隆抗体并检验其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的Nsp9基因保守区域片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组Nsp9蛋白;纯化后的重组Nsp9蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化,采用皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光试验检验其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为951 bp的Nsp9基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-28a-Nsp9构建成功;重组Nsp9蛋白的分子质量约为36.0 ku;制备的多克隆抗体效价较高,重组Nsp9蛋白多克隆抗体经2～8倍倍比稀释时,与PBS对照相比荧光数量递增。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组Nsp9蛋白,制备的鼠源多克隆抗体有一定的抗PRRSV中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)14 d后就可以产生针对非结构蛋白(Non-Structural Protein 7,Nsp7)的抗体,而且抗体水平很高,与N蛋白抗体水平相似,但比N蛋白抗体持续时间更长。另外,检测Nsp7抗体可用于区分PRRSVⅠ型和Ⅱ型的感染。本试验旨在建立一种快速、特异且敏感的检测血清中PRRSV抗体的方法。试验根据NCBI数据库录入的Nsp7蛋白序列(GenBank:EF536003)设计引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Nsp7基因,构建原核表达载体pET28a-Nsp7,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,Western Blot鉴定表达产物。将纯化后的重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其条件进行优化,最终建立检测PRRSV Nsp7抗体的间接酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法。结果表明,试验表达了重组Nsp7蛋白,重组的Nsp7蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,建立了一种基于重组Nsp7蛋白的间接ELISA检测方法。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PRRSV抗体检测试剂盒检测结果相比,两者符合率为87.74%。试验表明,建立的间接ELISA方法可以用于PRRSV抗体的检测。     

猪IL-10基因的原核表达纯化及功能鉴定

为进一步研究猪IL-10及其生物活性,本研究将猪IL-10基因克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,并成功获得其重组蛋白。用IPTG诱导重组蛋白表达,通过GST-亲和柱层析对重组蛋白进行纯化,将纯化的重组蛋白处理猪肺泡巨噬细胞,显著抑制PRRSV感染诱导的IL-12表达,将重组蛋白免疫家兔以制备抗血清,然后利用双向琼脂扩散方法、Western Blot试验对抗血清效价、特异性等生物活性进行了检测。结果表明,该抗血清具有较高的抗体效价和很好的特异性,可以作为IL-10特异性抗体用于今后的试验研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白特异性纳米抗体的原核表达及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV GP5蛋白特异性纳米抗体VHHGP5基因片段为模板,使用PCR对目的片段进行扩增,将扩增的片段经双酶切处理后连接到pColdSUMO-FLAG载体上,随后转化至E.coli TOP 10感受态细胞。经菌液PCR鉴定,将构建成功的重组质粒转化至E.coli BL21 （DE3）感受态细胞,用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达,表达产物通过Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析表达及纯化后的蛋白,同时使用ELISA方法检测纯化后的纳米抗体效价,并使用Western blot鉴定纯化后的蛋白。SDS-PAGE结果显示,成功获得了大小约36 kDa的重组蛋白,利用原核表达系统制备的PRRSV GP5特异性纳米抗体重组蛋白以可溶性形式表达;ELISA结果显示,该纳米抗体结合抗原的效价为1:50 000;Western blot结果显示,该纳...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SGQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增，将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中，构建了重组质粒pET-nsp4，测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21（DE3），用IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明，重组菌可表达分子质量约23ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化，获得了高纯度的重组蛋白，Western-blot分析结果表明，nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

仙台病毒核蛋白的原核表达及鉴定

本研究从一株鼠仙台病毒（Sendai virus,SeV）中扩增获得核蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将其克隆入pET32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明：该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV）HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2（Nonstnduralprotein2）蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11（^749KGEPvsdqpak^759）能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变（S754）处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸（^754SDQPAK^759）C端缩短到第3个氨基酸（^749KGEPVSDQ^757）时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。     

鸡毒支原体烯醇化酶的可溶性表达及检测

烯醇化酶参与支原体糖酵解、细胞黏附及免疫调节等多种生命活动,对其开展功能研究有助于了解鸡毒支原体黏附及感染机制。本研究通过重叠PCR克隆获得鸡毒支原体烯醇化酶,经原核表达获得可溶性融合蛋白rMGEno,将纯化产物免疫BALB/c小鼠后制备获得特异性多抗。通过Western blot和ELISA检测发现,烯醇化酶在鸡毒支原体不同强弱毒株中高度保守,表达产量高,在鸡毒支原体参试各毒株的细胞膜中均有分布。这一表达产物的成功制备为深入研究鸡毒支原体烯醇化酶的生物学功能奠定了基础。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及免疫原性分析

构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。