猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。     

结核分枝杆菌rv0394c基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其粘附特性的鉴定

本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细胞)互作,通过激光共聚焦显微镜观察到蛋白对细胞的特异性粘附。为进一步验证该试验结果,将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MV262中,将重组质粒电转化于非致病性的耻垢分枝杆菌中进行表达。构建的重组菌与A549细胞进行互作,结果表明重组菌可以粘附于A549细胞表面,而且这种粘附能够被RV0394c重组蛋白所阻断,这些结果表明RV0394c蛋白具有粘附细胞的能力,属于该菌的粘附蛋白之一。RV0394c蛋白粘附特性的鉴定为进一步研究该蛋白在致病性中的作用提供了实验依据。     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性 Ｐ Ｃ Ｒ 方法。通过对纯化后 Ｉ Ｂ Ｖ核蛋白基因进行直接 Ｐ Ｃ Ｒ及套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增表明，两次 Ｐ Ｃ Ｒ 产物的大小为０．７ ｋｂ 和０．５ ｋｂ，与实际设计相符。而对照的 Ｎ Ｄ Ｖ 及 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物均为阴性。用 Ｉ Ｂ Ｖ Ｈ Ｂ株感染 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后，应用我们所建立的 Ｐ Ｃ Ｒ 方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 Ｉ Ｂ Ｖ，在 Ｓ Ｐ Ｆ鸡感染 Ｉ Ｂ Ｖ后的２１ ｄ 仍然能够检测到 Ｉ Ｂ Ｖ 的基因组， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 杂交试验证明了我们获得的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物为 Ｉ Ｂ Ｖ 的核蛋白基因。该 Ｐ Ｃ Ｒ 检测方法比免疫荧光抗体（ Ｆ Ａ）法更具敏感、特异、快速等特点，完全适用于不同来源及不同血清型 Ｉ Ｂ Ｖ 的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源 …

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）核蛋白基因序列，设计并合成１对引物。应用这对引物，以ＲＴ－ＰＣＲ特异性扩增出华南分离株（ＨＮ株）的核蛋白基因，基因产物大小为１．５ｋｂ，与设计相符。对ＨＮ株部分核蛋白基因进行序列测定，并与标准毒株Ｈ５２，Ｍ４１，Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ的核蛋白基因进行同源性比较，结果表明，ＨＮ株与Ｈ５２、Ｍ４１、Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ株的核酸同源性分别为８５％、８４％８４％和８     

鸡常见病临床验方简介

笔者从事鸡病临床诊治多年,积累了较为有效常见鸡病临床验方,现介绍如下.     

副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失,并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善,现有的PTB疫苗保护效果不佳,并且干扰牛结核病的诊断,因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白,并对其免疫保护效果进行评价,为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因,分别构建5种重组质粒,在获得5种重组蛋白基础上,联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠,通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原;随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合,经皮下多点注射免疫小鼠,在二免...     

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD₅₀)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰ CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD₅₀;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD₅₀剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD₅₀为10^9.25 CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础。     

牛分枝杆菌ag85b-esat-6融合基因的克隆表达

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6基因和ag85b-esat-6融合基因,克隆到真核载体pcDNA3.1( )上,构建重组质粒pCAE,将该重组质粒体外转染小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞),间接免疫荧光试验检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功构建了真核表达质粒pCAE,转染后的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b-esat-6融合基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制牛结核病DNA疫苗奠定了基础.