胶体金免疫层析条诊断家畜日本血吸虫病的现场应用

为评估快速胶体金免疫层析条(colloidal gold imunochromatography assay,GICA)诊断现场家畜日本血吸虫病的价值,以GICA法对来自湖南血吸虫病流行区和非流行区的山羊、水牛、黄牛血清进行栓测,并和间接血凝法(indirect haemagglutination test,IHA)及粪便孵化法的诊断结果进行比较.结果显示,GICA对流行区284只山羊、172头水牛和145头黄牛血清检测,阳性率分别为10.21%、8.14%、8.28%;对非流行区的30只山羊、25头水牛、17头黄牛检测,假阳性率分别为10%、12%和11.76%.GICA和IHA的诊断结果相比,阳性符合率分别为93.8%、100%、100%,阴性符合率分别为99.7%、98.9%、98.7%;GICA与粪便孵化法的诊断结果相比,阳性符合率均为100%,阴性符合率分别为94.6%、96.9%、94.3%.可见,GICA法快速、简便,可以代替现行的IHA和粪便孵化检查法,用于疫区家畜血吸虫痛的筛查.     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白筛选噬菌体展示抗原对小鼠血吸虫病免疫效果观察

在前期研究中我们利用日本血吸虫抱雌沟蛋白筛选日本血吸虫噬菌体展示cDNA文库,共获得10种阳性噬菌体克隆。本研究选择其中5种噬菌体克隆单独或联合免疫小鼠,观察其对血吸虫成虫合抱的影响以及对血吸虫病的免疫预防效果。结果显示,19号克隆单独免疫和6号、18号混合免疫在预防实验中分别取得了40.53%和31.14%的减虫率及35.31%,44.65%的肝脏减卵率。研究结果提示,19号、6号和18号噬菌体展示的EST序列编码基因具有一定的抗血吸虫生殖免疫效果,在血吸虫疫苗研究方面具有重要价值。     

东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因，探索其分子机理，我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织／器官裂解物共培养，比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果，之后，以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针，以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后，随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析，获得了19个有效EST序列，其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源，4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示，其中6个为卵壳蛋白（Eggshell protein）相关基因，10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示，东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达，进而影响血吸虫的发育，可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

2012年全国家畜血吸虫病疫情状况

本文通报了2012年全国家畜血吸虫病疫情状况。在2012年,湖南省、湖北省、江西省、四川省、安徽省、云南省、江苏省等7省共有存栏牛1 033 056头,存栏羊2 024 512只,其他家畜存栏数891 301头（匹、只）。2012年共检查了684 899头牛,其中牛血吸虫病阳性3961头,阳性率0.58%,比2011年的阳性数下降了42.57%;检查了71 473只羊,其中羊血吸虫病阳性406只,阳性率0.57%,比2011年的阳性数下降了4.19%,并对142 976头其他家畜进行了检查,其中血吸虫病阳性为21头,阳性率0.01%。湖南省和江西省的病牛数占到了全国病牛数的80.06%。2012年,全国家畜血吸虫病疫情较之2011年继续下降,但是洞庭湖和鄱阳湖地区依然是今后家畜血吸虫病疫情控制的难点和重点。     

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础.用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA.在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端.用Mini Column纯化、收集300 bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库.经测定,库容量为1.3×107 PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011 PFU/mL.对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200 bp～1 000 bp,其中有95.5%的插入片段大于300 bp.用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%.     

日本血吸虫童虫冷冻保藏复苏后生活史循环的研究

本文报告了日本血吸虫童虫经液氮冻藏复苏后的生活史循环的情况。童虫冻藏３６天和５０天后腹腔注射感染小鼠，亲代成虫回收率为９．０和８．９％。感染鼠肝内的子代虫卵孵出的子１代毛蚴感染钉螺，感染率为５９和６７％；平均每个钉螺第１次逸出的子１代尾蚴数为８００～９００条。子１代尾蚴感染小鼠后，其子１代成虫回收率为５５和５６％。合抱雌、雄成虫的体长、性腺的发育和虫体对宿主的致病力与正常途径感染者无明显差异。     

寄生虫生物材料资源保藏技术规范实施细则

寄生虫生物材料资源,是开展寄生虫学和寄生虫病防治研究等科技活动的物质基础,对其收集、整理、保藏和管理是科技部平台项目《寄生虫虫种资源标准化整理、整合和共享试点》的重要任务之一。本研究所制定的“寄生虫生物材料资源保藏技术规范”的实施细则,内容包括原则、寄生虫生物材料资源的范围、生物材料资源的质量要求、生物材料资源样品及保藏的标准、生物材料保藏技术的标准、保藏与共享程序的标准等内容。希望国内同行对此提出宝贵意见,以使该项工作符合标准化要求,同时提供相关资源,扩大寄生虫生物材料库的数量与质量,并在工作中充分利用生物材料库的资源,更好地实现资源共享,加速研究成果应用。     

pVAX1/SjTSP2 DNA疫苗免疫预防小鼠日本血吸虫病的效果评估

为评估SjTSP2分子作为日本血吸虫DNA疫苗候选抗原分子的潜力,本实验扩增了编码该分子的DNA片段,构建了重组真核质粒pVAX1/SjTSP2,检测其在哺乳动物细胞中表达情况后,通过基因枪轰击法免疫小鼠,应用ELISA、流式细胞术等检测重组质粒诱导的免疫反应,计算减虫减卵率,评估对小鼠日本血吸虫病的免疫保护效果。间接免疫荧光试验结果显示该质粒能在293T细胞中表达。质粒免疫小鼠诱导了显著升高的特异性IgG抗体和IFN-γ、IL-4等细胞因子。小鼠免疫保护试验结果表明,免疫组小鼠虫荷数较PBS对照组增加12.4%(P=0.368),但肝组织虫卵减少10.01%(P=0.486)。说明制备的DNA疫苗能刺激小鼠产生较强的免疫反应,但诱导的免疫保护作用并不理想,为血吸虫DNA疫苗研究提供了参考数据。