猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２～１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ，１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％（３１／４８），５５．３％（２６／４７）和３４．５％（１９／５５）。６１枚重组胚移入同步发情的５头受体母猪输卵管，１头于妊娠１１７ｄ产下５头核移植仔猪。结果表明，激活卵母细胞作核受体优于未激活卵母细胞。成熟卵母细胞的胞质对于移入的核具有重排能力     

猪胚胎细胞核移植重组胚发育能力的研究

选用香猪2-～16-细胞期卵裂球作核供体,上海白猪卵母细胞作核受体.通过显微操作和电融合技术构成重组胚.体外培养时,以融合前1h激活、融合前2h激活及融合前不激活的卵母细胞作核受体的重组胚,发育率分别为65.8%,53.1%,33.3%.以体内、体外成熟卵母细胞作核受体胞质时,其重组胚的发育能力无显著变化(P＞0.05).作为核供体的胚胎对于重组胚的发育能力有显著影响,母体合子转变以后的胚胎作为核供体时,重组胚的发育能力下降;分别以不同细胞期胚胎(2-,4-,8-和16-细胞)的卵裂球作为核供体的NT胚发育率有显著差异(P＜0.05),以2-～4-细胞胚胎卵裂球作核供体最合适.     

家兔胚胎细胞核移植的研究

兔超排后收集卵母细胞和１６细胞胚，以Ｍｃ－Ｇｒａｔｈ－Ｓｏｌｔｅｒ和Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ两种去（注）核方法，将１６细胞胚细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内，经体外培养或中间受体培养，使移核胚发育．结果表明：（１）兔胚核移植中上述两种去（注）法的成功率无差异；（２）ｈｃＧ注射后１３～１５ｈ，６７．８％的卵母细胞保留有第一极体；（３）强度为０．６３ｋＶ／ｃｍ，持续１６０μｓ的一次电脉冲可使７０．８％的注核胚融合，同样的电脉冲刺激卵母细胞的活化率为６１．１％；（４）兔移核胚在中间受体内或体外均可发育，在中间受体内有２３．０％可以发育到桑椹胚或囊胚．     

小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电脉冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外培养并观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，①以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞，激活卵的桑椹胚最高发育率为６９％．②用７％酒精刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％．     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ．Ｌ＾－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ．ｍｍ＾－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＴ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明,虽然乙醇处理的活化率略高于电刺激,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著,说明电场作用后卵母细胞的活动更符合正常的活化规律。     

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ·Ｌ－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ·ｍｍ－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＧ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明：虽然乙醇处理的活化率（５５．４０％）略高于电刺激（４６．９０％）,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育率分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著（Ｐ＜０．０１）．说明电场作用后卵母细胞的活动更符合其正常的活化规律。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电泳冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外工观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，（１）以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５％／ｍｍ，脉０宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

 【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带，去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后，体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8％和93.6％；胚胎2-细胞发育率为24.7％，4-细胞率为6.74％；2-细胞期克隆胚移植假孕受体后，没有获得怀孕受体；分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果表明，冷冻保存细胞的融合率（69.3％）与其余两组（80.6％和84.8％）呈显著差异（P＜0.05）；激活率、2-细胞和4-细胞发育率，则3组间差异不显著（P＞0.05）。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合，获得的克隆胚目前已发育到4－细胞期；另外，供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，提高核移植总效率。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

研究改进了兔胚胎细胞核移植的技术体系,并对核移植胚胎的体外培养以及克隆胚胎的体内发育进行了试验。结果表明：卵母细胞去核率为８８．９％（８／９）,重组胚融合率为７６．７％（１７６／２２９）,将融合的重组胚与兔胎儿成纤维细胞共同培养,其２￣４细胞发育率、８￣１６细胞发育率以及桑椹胚和囊胚的发育率分别为６５．７％（２３／３５）、２８．６％（１０／３５）、２２．９％（８／３５）,显著高于“ＴＣＭ－１９９＋１０％ＦＣＳ”系统培养的４３．３％（１３／３０）、２６．７％（８／３０）、１６．７％（５／３０）。１６及３２细胞期卵裂球的重组胚可发育到产仔,将１１１枚重组胚移植给９只同期处理的受体母兔,２只妊娠,其中１只产出２只足月克隆仔兔,１只在产前１周（妊娠２２ｄ）流产。     

山羊同步发情和超排后取卵时间的研究

间隔９～１４ｄ分２次进行ＰＧＦ＿（２α）处理，以调整母羊的性周期。处理后的同步率分别为４７．６４％和６５．８８％。用ＰＭＳＧ或ＦＳＨ对４１９只母羊进行超排，总有效率７５．８１％，有效羊平均每只获卵７．６４枚。超排母羊发情后２０～３０ｈ回收的卵母细胞，可用率８５．９３％。用于山羊细胞核移植中的受体卵母细胞，适宜的回收时间为超排母羊发情后（２７±１）ｈ。在进行山羊原代细胞核移植时，以８～１６细胞期、桑椹期至囊胚期的分裂球或内细胞团细胞作供核的胚胎，适宜的获取时间为超排母羊发情交配后９６～１４４ｈ。     

家兔细胞核移植技术研究

以家兔16－32细胞期胚胎卵裂为核供体，显微注射到去核卵母细胞周隙中，共制作完成229枚重组胚，2次电融合后率达到76．8％。重组胚与兔胚成胎成纤维细胞共同培养，卵裂率为65．7％（23／35），桑囊率达到22．9％（8／35），均显著高于（P＜0．01）微滴直接培养结果（43．3％、13／30；16．7％，5／30）。将111枚重组胚手术移植到9只同期发情的受体母兔输卵管中，2只妊娠，其中1只完成足月胚胎发育产出克隆仔兔2只。     

谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对克隆重组胚发育率的影响.试验中选择成熟培养20～22 h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的卵母细胞在添加不同浓度谷氨酰胺的体外培养液中进行培养.结果显示,体外培养液中添加浓度为1....     

延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究

以体外成熟培养22-24h的延边黄牛卵母细胞作为受体,颗粒细胞为供核细胞,挤压法去核,注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中,甘露醇融合液中施加20μs时长的电脉冲刺激使之融合,复合化学方法激活,从融合前恢复培养时间、融合电场强度、甘露醇浓度等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件．结果表明,2．5h处理组的融合率（70．9％）显著高于4．0h处理组（58．2％,P〈0．05）,2．5h处理组重组胚的卵裂率（77．9％）显著高于其它4组（P〈O．05）,其它各组间差异不显著（P〉0．05）;融合电场强度1100V／cm处理组的融合率（86．4％）显著高于900V／cm处理组（67．1％）和1200V／cm处理组（75．2％,P〈O．05）,重组胚的卵裂率（84．6％）显著高于900V／cm处理组（69．6％,P〈O．05）,囊胚发育率（26．1％）显著高于900V／cm处理组（10．0％）,1200V／cm处理组（8．0％,P〈O．05）;不同浓度的甘露醇对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响,但是0．28mol／L组囊胚发育率（25．3％）显著高于0．25mol／L组（15．3％,P〈0．05）．因此,适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢复培养2．5h,0．28mol／L甘露醇作为融合液,电场强度1100V／cm．     

小鼠2细胞胚卵裂球电融合的研究

分别用８００ｖ／ｃｍ、４０～８０μｓ的单个电脉冲；８００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１２００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的２个电脉冲所获得的胚胎融合率分别为８４．６％（３３／３９），１００．０％（５９／５９），９７．４％（７４／７６），９５．１％（３９／４１），６４．７％（１１／１７）。融合胚作培养后，２细胞胚的发育率分别为１５．２％（５／３３），３９．０％（２３／５９），４７．３％（３５／７４），４３．６％（１７／３９），１８．２％（２／１１）。以１０００ｖ／ｃｍ，１６０～３２０μｓ的单个脉冲诱导注射ＬＨ３９～４３ｈ，４４～４８ｈ回收的２细胞胚，胚胎融合率分别为１００．０％（２７／２７），９６．４％（２７／２８）；发育率分别为４４．４％（１２／２７），３３．３％（９／２７）。２细胞胚卵裂球融合的适宜条件为１０００ｖ／ｃｍ和１６０～３２０μｓ的单个脉冲。     

小鼠卵母细胞的乙醇激活

昆明鼠卵母细胞ｈＣＧ注射后１８－１９ｈ用体积分数为７％的乙醇作用５－６ｍｉｎ，能够获得较为理想的激活效果，激活率高达９０％。乙醇激活处理时，卵丘细胞以及细胞外Ｃａ＾２＋，Ｍｇ＾２＋的有无对卵子的激活效果均无显著影响。     

小鼠电融合胚胎发育影响因素的研究

电融合技术，是获得四倍体胚胎的主要手段．本试验研究了各种不同因素，对小鼠电融合胚发育的影响．结果表明，电刺激前后，使用不同的操作液对融合胚发育有影响．电刺激前使用Ｍ２液、电刺激后在Ｗｈｉｔｔｅｎ氏液中融合，然后转入ＣＺＢ液中培养，这一操作体系（Ｍ／Ｗ—ＣＺＢ）效果最好，融合胚的囊胚发育率为８０．５％，显著高于Ｍ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—ＣＺＢ组，后者的囊胚发育率分别为０，０，５４．５％（Ｐ＜０．０５）．试验还发现，刺激强度为１．０ｋｖ／ｃｍ，８０μｓ；１．０ｋｖ／ｃｍ．４０μｓ和０．８ｋｙ／ｃｍ，８０μｓ时，融合囊胚的发育率分别为７９．０，８１．９和７１．１％．ＨＣＧ注射后４７ｈ、４８ｈ的２—细胞胚胎的融合胚发育率，显著高于（Ｐ＜０．０１）ＨＣＧ注射后４２ｈ、４４ｈ和４６ｈ的，囊胚发育率分别为８２．９，８０．６，０，０和２２．８％．     

山羊同步发情和超排后取卵时间的研究

间隔９－１４ｄ分２次进行ＰＧＦ２α处理，以调整母羊的周期。处理后的同步率分别为４７．６４％和６５．８８％。用ＰＭＳＧ或ＦＳＨ对４１９只母羊进行超排，总有效率７５．８１％，有效羊平均每只获卵７．６４％枚。超排母羊发性情后２０－３０ｈ回收的卵母细胞，可用率８５．９３％。用于山羊细胞核移植中的受体卵母细胞，适宜的回收时间为超排母羊发情后（２７±１）ｈ。在进行山羊原代细胞核移植时，以８－１６细胞期，桑椹期     

鼠、兔核质杂交及早期胚胎发育的研究

以2~8细胞期鼠胚细胞为供体核,选用注射hCG后15h、17h的兔卵母细胞为受体胞质,施加1.6kv/cm、160、两次脉冲的电场条件,间隔20min,融合液为含Ca、Mg的0.3mol/L甘露醇,适于鼠、兔种间EOBC的融合激活。小鼠2-细胞、4-细胞期胚细胞与兔去核卵母细胞融合率高于8-细胞期胚细胞,分别为83%、80%及62.5%,桑囊胚发育率差异不显著。体细胞共同培养系统和Taurine能显著提高鼠、兔核质杂交胚的体外发育能力。     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。