小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电脉冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外培养并观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，①以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞，激活卵的桑椹胚最高发育率为６９％．②用７％酒精刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％．     

脉冲场强和波形对小鼠卵母细胞电活化效果的影响

实验以一定持续时间与不同场强搭配的一次电脉冲对注射ｈＣＧ后１７和１９ｈ的小鼠卵母细胞进行电刺激，研究脉冲场强和波形对印母细胞活化效果的影响．结果说明：（１）在一定持续时间下，只有当场强增至一定值时才获得较高活化率（ｈＣＧ后１７ｈ卵，４０％～５５％左右；ｈＣＧ后１ｇｈ卵，４２％～７０％左右）；（２）在某一持续时间，获得较高活化率的场强不止一个，而是有一定范围；低于这一范围的场强因刺激强度不够至使许多卵母细胞不能活化，高于这一范围的场强则因刺激强度过大造成卵大量死亡而使活化率下降；（３）随脉冲持续时间倍减，获较高活化率的场强约以０．２ｋＶ／ｃｍ的强度递增；（４）与注ｈＣＧ后１７ｈ卵相比，ｈＣＧ后１９ｈ卵获较高活化率的场强范围更宽；（５）在同等条件下，不规则波形脉冲的卵活化率、碎裂率和死亡率都明显高于方波脉冲．     

家兔胚胎细胞核移植的研究

兔超排后收集卵母细胞和１６细胞胚，以Ｍｃ－Ｇｒａｔｈ－Ｓｏｌｔｅｒ和Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ两种去（注）核方法，将１６细胞胚细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内，经体外培养或中间受体培养，使移核胚发育．结果表明：（１）兔胚核移植中上述两种去（注）法的成功率无差异；（２）ｈｃＧ注射后１３～１５ｈ，６７．８％的卵母细胞保留有第一极体；（３）强度为０．６３ｋＶ／ｃｍ，持续１６０μｓ的一次电脉冲可使７０．８％的注核胚融合，同样的电脉冲刺激卵母细胞的活化率为６１．１％；（４）兔移核胚在中间受体内或体外均可发育，在中间受体内有２３．０％可以发育到桑椹胚或囊胚．     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵母细胞电激活的主要参数，初步建立了电激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多而升高，含Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电脉冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、卵裂率、囊胚发育率分别为８６．０％，８６．５％及４８．９％     

猪卵母细胞的电激活

以湖北白猪体内或体外成熟卵母细胞为对象,研究不同直流脉冲条件、激活液Ｃａ＾２＋浓度及卵龄对猪卵母细胞电激活的影响,并比较了体内与体外成熟卵的激活率与发育率。结果表明,脉冲强度、脉冲次数、脉冲时间、Ｃａ＾２＋浓度及卵龄均可影响激活效果。１次脉冲就足以激活猪卵母细胞,脉冲时间以４０￣６０μｓ为优,强度以１２５０Ｖ／ｃｍ（体外成熟卵）或１５００Ｖ／ｃｍ（体内成熟卵）为优,激活液Ｃａ＾２＋浓度０．０５ｍｍ     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ·Ｌ－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ·ｍｍ－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＧ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明：虽然乙醇处理的活化率（５５．４０％）略高于电刺激（４６．９０％）,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育率分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著（Ｐ＜０．０１）．说明电场作用后卵母细胞的活动更符合其正常的活化规律。     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ．Ｌ＾－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ．ｍｍ＾－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＴ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明,虽然乙醇处理的活化率略高于电刺激,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著,说明电场作用后卵母细胞的活动更符合正常的活化规律。     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵细胞激活的主要参数，初步建立了激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多百升高，含Ｃａ６２＋、Ｍｇ＾２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电泳冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、裂率、囊胚发育分别为８６．０％     

小鼠2细胞胚卵裂球电融合的研究

分别用８００ｖ／ｃｍ、４０～８０μｓ的单个电脉冲；８００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１２００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的２个电脉冲所获得的胚胎融合率分别为８４．６％（３３／３９），１００．０％（５９／５９），９７．４％（７４／７６），９５．１％（３９／４１），６４．７％（１１／１７）。融合胚作培养后，２细胞胚的发育率分别为１５．２％（５／３３），３９．０％（２３／５９），４７．３％（３５／７４），４３．６％（１７／３９），１８．２％（２／１１）。以１０００ｖ／ｃｍ，１６０～３２０μｓ的单个脉冲诱导注射ＬＨ３９～４３ｈ，４４～４８ｈ回收的２细胞胚，胚胎融合率分别为１００．０％（２７／２７），９６．４％（２７／２８）；发育率分别为４４．４％（１２／２７），３３．３％（９／２７）。２细胞胚卵裂球融合的适宜条件为１０００ｖ／ｃｍ和１６０～３２０μｓ的单个脉冲。     

猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２～１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ，１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％（３１／４８），５５．３％（２６／４７）和３４．５％（１９／５５）。６１枚重组胚移入同步发情的５头受体母猪输卵管，１头于妊娠１１７ｄ产下５头核移植仔猪。结果表明，激活卵母细胞作核受体优于未激活卵母细胞。成熟卵母细胞的胞质对于移入的核具有重排能力     

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外受精试验

抽吸法采集２￣６ｍｍ山羊卵巢大腔卵泡卵母细胞后，以１．５ｍｍ间距纵横切割卵巢，回收（２ｍｍ小腔卵泡卵母细胞。随机测量其直径为１２９．８６±１８．８４μｍ。将２１８枚卵丘细胞层致密完整的卵母细胞分别培养于含颗粒细胞并用２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ缓冲的①ＴＣＭ１９９＋１％ＧＳ，②①＋ＦＳＨ，ＬＨ（１０μｇ／ｍＬ）＋１７β－Ｅ２（１μｇ／ｍＬ），③②＋ＩＴＳ（５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ     

不同因素对小鼠卵母细胞电激活及孤雌发育的影响

研究了卵龄、电脉冲参数、氯化锶、亚胺环己酮(CHX)对小鼠卵母细胞电激活及孤雌发育效果的影响。结果表明,卵龄为17h的小鼠卵母细胞在场强1.0kV/cm,脉冲宽度30μs,2次电脉冲,激活液中含Ca2+、Mg2+和Sr2+的条件下激活后,再于含CHX的培养液中培养,可较好地激活卵母细胞,提高体外孤雌胚的发育率,激活率及桑囊胚率分别可达83.3%和57.5%。     

猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２￣１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ、１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％，５５．３％和３４．５％。     

体内外成熟与老化对小鼠卵激活刺激敏感性的影响

小鼠体外成熟卵母细胞组的乙醇激活率显著低于体内成熟卵母细胞组水平,在体外成熟过程中（培养液：ＴＣＭ－１９９＋ＦＣＳ（２０％）＋ｈＣＧ（２ＩＵ／ｍｌ））卵丘细胞的存在极显著地降低了成熟卵的乙醇激活率,卵激活率由５８．７％（裸卵）降为１３．８％（卵丘卵母细胞复合体）超排卵子随着卵龄的增加,卵子的乙醇激活率逐渐升高,而且体内卵的激活率高于体外老化同龄组的水平。     

小鼠电融合胚胎发育影响因素的研究

电融合技术，是获得四倍体胚胎的主要手段．本试验研究了各种不同因素，对小鼠电融合胚发育的影响．结果表明，电刺激前后，使用不同的操作液对融合胚发育有影响．电刺激前使用Ｍ２液、电刺激后在Ｗｈｉｔｔｅｎ氏液中融合，然后转入ＣＺＢ液中培养，这一操作体系（Ｍ／Ｗ—ＣＺＢ）效果最好，融合胚的囊胚发育率为８０．５％，显著高于Ｍ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—ＣＺＢ组，后者的囊胚发育率分别为０，０，５４．５％（Ｐ＜０．０５）．试验还发现，刺激强度为１．０ｋｖ／ｃｍ，８０μｓ；１．０ｋｖ／ｃｍ．４０μｓ和０．８ｋｙ／ｃｍ，８０μｓ时，融合囊胚的发育率分别为７９．０，８１．９和７１．１％．ＨＣＧ注射后４７ｈ、４８ｈ的２—细胞胚胎的融合胚发育率，显著高于（Ｐ＜０．０１）ＨＣＧ注射后４２ｈ、４４ｈ和４６ｈ的，囊胚发育率分别为８２．９，８０．６，０，０和２２．８％．     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的、胞质不均匀和不含卵丘细胞胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３者差异极显著。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液培养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显著。Ｅ，Ｃ，Ｆ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ＿２能显著地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液［加入２×１０￣（－６）ｍｏｌ／（Ｌ·ｓ）ＦＳＨ］培养的成熟率分别为５０％，４４．４％，受精后的卵裂率分别为１６％，１０％，成熟率、卵裂率间均无显著差异。卵母细胞体外成熟培养３６，４０，４４ｈ后授精，其相应的受精率分别为２６．７％，４４．４％，４５．８％；卵裂率分别为０．３０％，２０％；以培养４０，４４ｈ的效果稍好，但三者差异不显著。     

水牛卵母细胞孤雌激活方法研究

对体外成熟（ＩＶＭ）２７￣２８ｈ的水牛卵母细胞经７％酒精（ＥＨ）激活处理５ｍｉｎ后,置入不同浓度的（０,０．６２５μｇ／ｍｌ,１．２５μｇ／ｍｌ,２．５μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ）放线功酮（ＣＨＸ）培养１０ｈ,而后固定染色或在胚胎培养液（ＣＭ）中继续培养检查激活分裂率。结果培养在０．６２５μｇ／ｍｌ和１．２５μｇ／ｍｌ ＣＨＸ的卵母细胞的激活分裂率和总原核形成率明显高于对照组（Ｐ〈０．０５）,而培养     

特定电磁波照射对家兔体外受精的影响

家兔精液用特定电磁波（ＴＤＰ）照射３ｍｉｎ，精子体外获能采用ｍ—ＨＩＳ（１５ｍｉｎ）＋ｍ－ＤＭ（２－４ｈ）．家兔卵母细胞经ＴＤＰ照射５ｍｉｎ并体外培养１０－１２ｈ．家兔的卵泡卵母细胞经体外受精和体外培养的结果表明，经ＴＤＰ照射的精液与未经ＴＤＰ照射的卵母细胞的体外受精，原核形成率达６４．７％，对照织为４４．４％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５６．８％和５０％（Ｐ＞０．０５），经ＴＤＰ照射的卵母细胞与未经ＴＤＰ照射的精液的体外受精，原核形成率达６３．７％，对照组为４６．７％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５８．９％和４７．２％（Ｐ＞０．０５）、用ＴＤＰ照射精液或卵母细胞能显著提高其体外受精率．     

特定电磁波照射对家兔体外受精的影响

家兔精液用特定电磁波（ＴＤＰ）照射３ｍｉｎ，精子体外获能采用ｍ－ＨＩＳ（１５ｍｉｎ）＋ｍ＿ＤＭ（２－４ｈ），家兔卵母细胞经ＴＤＰ照射５ｍｉｎ并体外培养１０－１２ｈ，家兔的卵母细胞经体外受精和体外培养的结果表明，经ＴＤＰ照射的精液与未经ＴＤＰ照射的卵母细胞的体外受精，原核形成率达６３．７％，对照组为４４．４％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５６．８％和５０％（Ｐ＜０．     

颗粒细胞和培养微滴大小对牛卵母细胞体外受精后胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为材料,研究了颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类,分别在体外成熟(IVM)和早期胚胎的体外培养(IVC)培养液中添加GCM,与不添加的对比;添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率无明显影响,但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。试验2将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴(30μl,50μl,100μl和200μl)中培养、受精,30μl和50μl组的囊胚发育率明显高于100μl和200μl组。