猪卵母细胞的电激活

以湖北白猪体内或体外成熟卵母细胞为对象,研究不同直流脉冲条件、激活液Ｃａ＾２＋浓度及卵龄对猪卵母细胞电激活的影响,并比较了体内与体外成熟卵的激活率与发育率。结果表明,脉冲强度、脉冲次数、脉冲时间、Ｃａ＾２＋浓度及卵龄均可影响激活效果。１次脉冲就足以激活猪卵母细胞,脉冲时间以４０￣６０μｓ为优,强度以１２５０Ｖ／ｃｍ（体外成熟卵）或１５００Ｖ／ｃｍ（体内成熟卵）为优,激活液Ｃａ＾２＋浓度０．０５ｍｍ     

小鼠卵母细胞的乙醇激活

昆明鼠卵母细胞ｈＣＧ注射后１８－１９ｈ用体积分数为７％的乙醇作用５－６ｍｉｎ，能够获得较为理想的激活效果，激活率高达９０％。乙醇激活处理时，卵丘细胞以及细胞外Ｃａ＾２＋，Ｍｇ＾２＋的有无对卵子的激活效果均无显著影响。     

转化生长因子β对体外成熟猪卵子成熟率的影响

在猪卵子的体外生产方面,关于卵子的体外成熟和体外受精技术目前还存在着不足,特别是猪的受精卵体外生产方面存在复杂的细胞质成熟、多精子侵入率较高以及前核形成受到抑制等问题。为改善猪卵子体外成熟体系,将转化生长因子β(transforming growth factor-β,简称TGFβ)添加到体外成熟的培养液中,研究TGFβ对裸卵和卵丘卵母细胞复合体成熟率的影响。在没有添加TGFβ的体外成熟培养液中,裸卵和卵丘卵母细胞复合体被成熟培养24 h,结果没有卵子达到M-Ⅱ时期,但是在添加TGFβ的体外成熟培养液中,观察到有卵子达到M-Ⅱ时期。另一方面,当卵丘卵母细胞复合体在体外成熟培养时,将TGFβ添加到不同培养阶段(0~24 h或24~48 h)的培养液时,卵子的成熟率没有差别。对裸卵在体外成熟培养24 h时,当在前半期添加TGFβ时(0~24 h),卵子的成熟率为59%;当在后半期添加TGFβ时(24~48 h),卵子的成熟率为57%。同样在裸卵组中,当在全期添加TGFβ时(0~48 h),卵子的成熟率为27%;当无添加TGFβ时,卵子的成熟率为38%。前2组与后2组相比,卵子成熟率有显著差异。     

亮甲酚蓝染色对水牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝（BCB）染色对水牛卵母细胞体外受精及孤雌激活胚胎发育的影响。[方法]卵丘卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟培养前用浓度26μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min,然后根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性（BCB＋,蓝色）和阴性组（BCB-,不着色）。以未经染色处理的COCs为对照组,控制对照组卵母细胞在含0.4%牛血清白蛋白（BSA）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中孵育90 min。体外成熟培养后统计各组的成熟率、体外受精和孤雌激活后的发育率。[结果]BCB＋组的成熟率（65.70%）显著高于对照组（59.86%）、控制对照组（58.42%）和BCB-组（48.86%）。在体外受精后的囊胚发育率方面,BCB＋组（27.08%）和对照组（25.49%）差异不显著,但显著高于控制对照组（20.50%）和BCB-组（8.45%）。在孤雌激活后的囊胚发育率方面,BCB-组显著低于其他各组,但BCB＋组、对照组以及控制对照组之间无显著差异。[结论]亮甲酚蓝染色筛选出的阳性卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但并不能显著提高卵母细胞体外受精及孤雌激活后的胚胎发育率。     

重组牛生长激素对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的影响

将３０７枚Ａ、Ｂ级卵丘－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）分别培养于：改良ＴＣＭ１９９＋ＦＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）＋ＬＨ（２０μｇ／ｍｌ）＋２０％ＮＣＳ（Ａ液）、Ａ液＋重组牛生长激素（ｒｂＧＨ）１５ｎｇ／ｍｌ、改良ＴＣＭ１９９＋ｈＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｒｂＧＨ＋２０％ＮＣＳ三种培养基中，获得５３１％、６７９％和６３５％的成熟率。结果表明，ｒｂＧＨ对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟是有益的。     

屠宰山羊卵母细胞的体外成熟培养

屠宰白山羊卵巢在２５～３５℃下于２～３小时运回实验室。每个卵巢获可培养卵丘细胞－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）０４２个（１９３４５６）；可培养ＣＯＣ在Ｍ１９９＋ｈＣＧ１ＩＵｍｌ＋１７－β－雌二醇１μｇｍｌ＋牛血清白蛋白１０ｍｇｍｌ＋庆大霉素５０ＩＵｍｌ的培养微滴中于５％ＣＯ２、空气、饱和湿度或标准气（５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）、饱和湿度，３９℃培养２４～２６小时，卵母细胞成熟率为９０３％（１８６２０６）。成熟卵母细胞体外受精率为７１５％（１３３１８６）。结果表明此培养系统适合于屠宰白山羊卵母细胞的体外成熟培养     

牦牛卵母细胞体外成熟培养及孤雌发育研究

牦牛体外胚胎培养作为辅助生殖策略，能够有效提高其繁殖能力。为研究牦牛卵母细胞体外培养过程中不同的处理方式对孤雌激活胚胎发育质量的影响，10月份采集5～8岁健康母牦牛卵巢，抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟诱导，设置卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexs,COCs）和裸卵2个试验组；TCM199培养时间分别为24、36 h；以及体外培养12 h的COCs，消化之后再移入TCM199培养12 h）分别进行孤雌激活，在体外进行孤雌胚胎培养，统计卵裂率和囊胚率。结果显示，牦牛COCs的孤雌激活胚胎发育率显著低于裸卵（P<0.05），且后期出现脱卵丘细胞现象；COCs在TCM199中培养24 h的孤雌胚胎卵裂率明显高于培养36 h的处理组（P<0.05）；裸卵再培养之后卵母细胞成熟率低、进行孤雌激活的卵裂率极低，且大部分发生贴壁。以上结果表明，体外培养24 h的COCs经透明质酸酶消化为裸卵的孤雌激活效果最佳，其卵裂率最高，囊胚率最高。研究结果为揭示牦牛卵母细胞孤雌激活前的不同处理方式与孤雌激活胚胎的发育质量提供了依据，可为优化卵母细胞体外培养、提高孤雌激活...     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵母细胞电激活的主要参数，初步建立了电激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多而升高，含Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电脉冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、卵裂率、囊胚发育率分别为８６．０％，８６．５％及４８．９％     

白山羊COC细胞质密度对卵母细胞体外培养成熟率和体外受精率的影响

按白山羊卵丘细胞—卵母细胞复合体（ＣＯＣ）的细胞质密度的不同，将其分成Ａ、Ｂ两个级别：Ａ级ＣＯＣ细胞质特别致密；Ｂ级ＣＯＣ细胞质比较致密。将Ａ级和Ｂ级ＣＯＣ分别放入相同的环境条件下培养２４～２６小时。Ａ、Ｂ两级ＣＯＣ的卵母细胞成熟率差异极显著（ｔ＝３．１６２５，Ｐ＜００１）。表明白山羊ＣＯＣ的细胞质密度与卵母细胞体外培养成熟率呈极显著正相关。Ａ级和Ｂ级ＣＯＣ经体外成熟培养后，其成熟卵母细胞的体外受精率差异不显著。     

卵巢皮质与输卵管上皮细胞对猪卵母细胞体外成熟与体外受精的影响

在猪输卵管上皮细胞（pOECs）与猪卵巢皮质细胞（pOCCs）共培养体系中进行猪卵子体外成熟（IVM）,研究比较了pOECs与pOCCs对猪卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精与胚胎发育的影响。结果显示：pOCCs或pOECs参与猪卵子体外成熟可显著提高卵丘扩散与MⅡ期卵子的比例（P<0.05）,然而GV期卵子的比例却没有显著减少（P>0.05）;pOCCs组内成熟卵子的GSH含量显著高于其余各组（P<0.05）,而GSH在pOECs组与对照组之间差异不显著（P>0.05）;尽管pOCCs和pOECs共成熟可显著降低多精入卵的比例（P<0.05）,但是受精率与雄原核形成率（MPN）在各组间却无显著差异（P>0.05）;pOCCs和pOECs共培养均可以显著提高卵裂率与囊胚发育率（P>0.05）,然而囊胚细胞数在处理组与对照组间没有显著性差异（P>0.05）。研究认为,pOCCs与pOECs共培养体系能显著提高猪卵母细胞IVM质量,降低多精入卵的发生,并提高囊胚发育率。     

川芎嗪和小檗碱对猪卵母细胞体外成熟效果的影响

以mTCM-199添加抗生素为对照组,以分别添加0．5μg／mL川穹嗪（1igustrazine,Lig）和0．1μg／mL小檗碱（berberine,BR）为试验组,初步探讨川芎嗪、小檗碱对猪卵母细胞体外成熟效果的影响,以期提高猪卵母细胞体外成熟率。试验结果表明：以卵丘扩散和第一极体排出率分别作为猪卵母细胞体外成熟的判断标准,Lig组和BR组均显著高于对照组（P〈0．05）,Lig组和BR组间无显著差异（P〉O．05）。结论：川芎嗪和小檗碱对猪卵母细胞体外成熟具有一定的促进作用。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考.[方法]在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MⅡ期卵母细胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况.[结果]在体外成熟液中添加10~20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数(CEI)分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率(59.31%和50.98%)显著高于未添加EGCG的CK组(P<0.05,下同),MⅡ期卵母细胞的GSH含量(3.21和3.25 pmol/枚)也显著高于CK组;添加20~30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MⅡ期卵母细胞的ROS水平.以体外成熟培养获得的水牛MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组.[结论]EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳.     

牛体外发育卵母细胞成熟的评估方法研究

为探讨不同评估方法对牛卵母细胞体外成熟的判定效果,以牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)为试验材料,采用比较卵丘扩展、形态学观察第一极体排出和固定染色观察第一极体3种方法评估牛卵母细胞成熟率的差异.结果表明,牛卵母细胞经体外24 h成熟培养后,卵丘扩展分级的成熟率为76.8％,形态学观察第一极体排出率为71.2％,固定染色观察第一极体核成熟率为77.1％,3种判定方法评估成熟率无显著差异(P＞0.05).因此,3种方法均可用于卵母细胞的体外成熟判定.     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的、胞质不均匀和不含卵丘细胞胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３者差异极显著。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液培养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显著。Ｅ，Ｃ，Ｆ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ＿２能显著地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液［加入２×１０￣（－６）ｍｏｌ／（Ｌ·ｓ）ＦＳＨ］培养的成熟率分别为５０％，４４．４％，受精后的卵裂率分别为１６％，１０％，成熟率、卵裂率间均无显著差异。卵母细胞体外成熟培养３６，４０，４４ｈ后授精，其相应的受精率分别为２６．７％，４４．４％，４５．８％；卵裂率分别为０．３０％，２０％；以培养４０，４４ｈ的效果稍好，但三者差异不显著。     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

不同因素对南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响

探讨了卵母细胞的不同采集方法对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，抽吸法是合适的卵母细胞采集方法。同时还探讨了卵丘细胞层数和不同激素对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明激素对南阳牛卵母细胞的成熟率和卵裂率无显著影响；具有2～8层卵丘细胞的卵母细胞获得了较高的成熟率和卵裂率；具有8层以上卵丘细胞的卵母细胞的成熟率和卵裂率比较低；裸卵和半裸卵几乎不能够成熟和卵裂。     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵细胞激活的主要参数，初步建立了激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多百升高，含Ｃａ６２＋、Ｍｇ＾２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电泳冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、裂率、囊胚发育分别为８６．０％