不同激活方法对绵羊体外成熟卵母细胞孤雌生殖的影响

为确定绵羊体细胞核移植胚胎的激活条件,本实验探讨了不同激活方法对绵羊体外成熟卵母细胞的孤雌激活及其后的发育影响.选择体外成熟绵羊卵母细胞,随机分为3组:①电激活 6-DMAP 4h;②I(5μm)5min 6-DMAP 4h;③7%乙醇7min 6-DMAP 4h,培养48h后,各组卵母细胞的卵裂率分别为60.93%,79.96%,78.28%;培养到7d时,各组的桑椹/囊胚发育率分别为17.03%,42.84%,39.39%.化学激活的卵裂率、桑椹/囊胚率显著高于电激活(P<0.05);乙醇与Ionomycin相比,其卵裂率、桑椹/囊胚率差异不显著,但Ionomycin处理组效果稍好于乙醇组.结果表明,电激活、Ionomycin、7%乙醇都可以有效激活绵羊卵母细胞,并孤雌发育到囊胚,Ionomycin的激活效果最佳;同时也比较了不同电压对绵羊体外成熟卵母细胞激活的影响,以1.300kV/cm-1.350kV/cm,脉冲时间10us,脉冲次数为2次,间隔0.5s效果较好.     

獭兔体外成熟卵母细胞孤雌激活及体细胞核移植

[目的]建立利用獭兔体外成熟卵母细胞进行孤雌激活及体细胞核移植的技术体系,促进獭兔现代育种技术的发展。[方法]以獭兔屠宰场废弃卵巢为试验材料,利用体外成熟、孤雌激活、体细胞核移植等方法,研究了獭兔体外成熟卵母细胞支持胚胎发育的能力。[结果]1)直径大于1 mm卵泡内的卵母细胞孤雌激活后的发育能力显著强于0.7~1.0 mm卵泡内的卵母细胞。2)卵母细胞体外培养(IVC)15~21 h后孤雌激活,卵裂率显著高于IVC 12 h组。3)2.5μmol·L-1Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-16-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)与5μg·m L-1亚胺环己酮(CHX)联合处理1 h,孤雌激活效果最好。4)IVC 14 h后,78%的卵母细胞极体与核偏移角度小于10°;IVC 18 h后,34.6%的极体偏离核的角度大于45°。5)体外成熟的獭兔卵母细胞可以较好支持体细胞核移植的重构胚,核质作用期间采用MG132处理,降低了重构胚的囊胚率。[结论]从大于1 mm卵泡内回收卵母细胞并IVC 18 h后,采用2.5μmol·L-1Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-16-DMAP与5μg·m L-1CHX联合处理1 h,是獭兔孤雌激活和体细胞核移植的最佳方案。     

EGF和FBS对牛孤雌胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液中分别添加0,10,30,50ng/mL表皮生长因子(EGF),24h检查成熟率,将成熟的卵母细胞置于5μmol/L离子霉素(Ionomycin)中激活5min后,在含有6-DMAP和CCB的培养液中培养4h,最后移入CR1培养液中培养,并在孤雌激活后第0,2,4,6天添加体积分数10%的胎牛血清(FBS),7～8d后检查囊胚率,探讨牛成熟培养液中添加EGF及FBS对牛孤雌胚体外发育的影响。结果表明,添加30ng/mL的EGF能促进卵母细胞的成熟率和孤雌囊胚的发育率;在第4天添加FBS更有利于胚胎的发育。     

几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响

为确定牛体细胞核移植胚胎的激活条件 ,比较了几种不同化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞 ,随机分为 9组 :1Ionomycin(I) +6 -甲氨基嘌呤 (D) (ID) ;2 I+D+细胞松弛素 B(CCB) (IDC) ;3I+放线菌酮 (X) (IX) ;4 I+X+CCB(IXC) ;5体积分数 7%乙醇 (E) +D(ED) ;6E+D+CCB(EDC) ;7E+X(EX) ;8E+X+CCB(EXC) ;9Sr2 + +CCB(SC)。Ionom ycin和乙醇的处理时间为 5min,6 - DMAP± CCB的处理时间为 4 h,放线菌酮± CCB的处理时间为 5 h,Sr2 + +CCB的处理时间为 10 h。培养36 h后 ,各组卵母细胞的卵裂率分别为 72 .0 % ,75 .5 % ,81.3% ,85 .1% ,81.7% ,82 .4 % ,74 .4 % ,78.1%和 5 1.0 % ;培养到 196 h时 ,各组的囊胚发育率分别为 18.2 % ,2 4 .5 % ,7.2 % ,11.9% ,11.1% ,19.4 % ,6 .7% ,12 .2 %和 2 .0 %。结果表明 ,在 10 mm ol/ L Sr2 +内培养 10 h不能有效地激活牛卵母细胞 ,Ionom ycin+6 - DMAP± CCB以及乙醇 +6 -DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionom ycin比乙醇对牛卵母细胞的激活作用强 ;6 - DMAP比CHX的激活效果好 ,激活液中 CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利     

牛卵胞质内显微受精中第一极体位置与激活方法研究

【目的】探讨牛卵母细胞胞质内显微受精(ICSI)操作中,卵母细胞第一极体位置以及受精卵化学激活方法对ICSI卵体外发育的影响。【方法】采集牛卵巢,成熟培养卵母细胞后,调整其第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置,进行牛卵母细胞胞质内显微受精,以ICSI卵不进行激活处理为未激活组,分别采用乙醇、离子霉素及离子霉素联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活ICSI卵,统计ICSI卵的形态完整率、卵裂率和囊胚发育率。【结果】第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置时,所获得的ICSI卵形态完整率(92.9%和94.0%)、卵裂率(37.1%和40.0%)和囊胚发育率(12.9%和12.2%)均无统计学差异(P>0.05)。未激活组ICSI卵的卵裂率较低,不能发育到囊胚;用乙醇或离子霉素激活时,ICSI卵的卵裂率(25.7%和27.6%)和囊胚发育率(3.3%和3.4%)均显著高于未激活组(7.5%和0)(P<0.05);用离子霉素与6-DMAP联合激活时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率分别为38.9%和13.9%,显著高于乙醇激活组、离子霉素激活组及未激活组(P<0.05)。【结论】对牛卵母细胞进行ICSI操作时,第一极体分别位于相当于时钟6点和12点位置时,对ICSI卵的发育无显著影响;采用离子霉素和6-DMAP联合激活,有利于ICSI卵的体外发育。     

绵羊卵母细胞孤雌发育的研究

系统地研究了绵羊卵母细胞成熟培养时间、6-DMAP激活时间以及改进的培养液对绵羊卵母细胞孤雌发育的影响.结果表明：卵母细胞成熟培养25 h和26 h激活组的囊胚率和孵化率显著高于成熟培养24 h激活组;6-DMAP激活液作用2 h,激活效果较好;培养液改进后,孤雌胚的囊胚率有上升趋势,但差异不显著.在本试验条件下,卵母细胞体外成熟培养25 h后在6-DMAP中激活2 h,利用改进后的培养液进行培养,能获得较好的发育效果.     

db-cAMP和卵丘细胞单层对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育潜力研究

为提高卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的能力,探讨了双丁酰基腺苷酸环化酶(db-c AMP)和卵丘细胞单层共培养对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育潜力。结果表明,成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-c AMP时,卵母细胞的体外成熟率依次降低,但浓度为1 mmol/L时的孤雌胚囊胚率(27.03%)显著高于其他各组(P0.05);卵丘细胞单层共培养卵母细胞时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养能够显著提高猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的发育潜力。     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

[目的]了解玻璃化冷冻一解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础.[方法]利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1～2d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响.[结果]与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低(P＜0.01).水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5 μmol/L离子霉素激活5 min联合2mmol/L 6-DMAP培养2h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6％、45.1％、33.7％和14.8％.[结论]水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活.     

牛卵母细胞的去核与激活

比较了Ionomycin(离子霉素)和乙醇及其与其他物质的组合激活牛卵母细胞的效果,并研究了去核时间、细胞松弛素B、末期去核等对去核效率的影响。结果表明,配合使用6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)或放线菌酮(CHX)可显著提高Ionomycin或乙醇激活牛卵母细胞的效率,Ionomycin+6-DMAP激活的牛孤雌胚在8/16细胞之后的发育率明显高于乙醇+6-DMAP(或CHX)。牛卵母细胞的去核在成熟培养20h或之前进行效果较好,此时有较高比率的卵母细胞中第一极体与染色体位置靠近。牛卵母细胞在不含细胞松弛素B的操作液中可进行去核,但所得核移植胚胎的卵裂率明显下降,而对8/16细胞胚之后的发育没有明显影响。牛卵母细胞的末期去核率显著高于中期,二者核移植胚胎的早期发育率基本相同。     

6-二甲基氨基嘌呤对体外成熟山羊卵母细胞孤雌激活及发育的影响

体外成熟的山羊卵泡卵母细胞用7%的乙醇和5μmol/L的离子霉素刺激处理后,分别置于含2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)和不含6-DMAP的培养液中培养4 h,研究6-DMAP对体外成熟山羊卵泡卵母细胞孤雌激活率、原核形成以及孤雌胚体外发育潜能的影响。结果表明:6-DMAP能显著提高山羊卵母细胞的激活率,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理卵母细胞激活率分别为75.6%和71.1%,均显著高于单独使用乙醇(54.3%)和离子霉素(56.8%)处理;显著抑制卵母细胞第二极体的排出,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理仅含1个极体的孤雌胚分别为90.3%和96.3%,显著高于单独使用乙醇(26.3%)离子霉素(33.3%)处理。孤雌胚体外培养7 d,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理4-细胞发育率为45.6%和47.9%,8-细胞孤雌胚发育率为25.0%和29.6%,桑/囊胚形成率为7.4%和9.9%,均显著高于单独使用乙醇和离子霉素处理(P<0.05)。     

不同化学激活方法对山羊卵母细胞激活效果的研究

激活是体细胞核移植技术的关键步骤。本研究对常用化学激活剂乙醇、钙离子载体A2 3187和离子霉素以及添加 6 二甲基氨基嘌呤 (6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)和放线菌酮 (cycloheximide ,CHX)对山羊卵母细胞的激活效果以及不同卵龄的卵母细胞激活后体外发育效果进行了比较。结果表明 :离子霉素处理组激活率显著高于乙醇和A2 3187处理组 (89.6 %vs 6 3.5 % ,6 8.7% ;P <0 .0 5 ) ;离子霉素 +6 -DMAP处理组激活率显著高于离子霉素 +CHX和离子霉素 +CHX +细胞松弛素D处理组 (90 .1%vs 5 8.9% ,6 3.7% ;P <0 .0 1) ;体外成熟 2 4、2 6、2 8h组桑椹胚率分别为 16 .0 %、2 0 .6 %和 33.3% ,30h组桑椹胚率下降 (13.8% )。以上结果说明 ,在本研究的激活条件下 ,山羊卵母细胞适宜的激活方法为 :成熟起始后 2 8h使用离子霉素和 6 DMAP进行联合激活。     

化学激活对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响

分别用不同浓度的氯化锶联合细胞松弛素、钙离子载体A23187和乙醇分别与6-二甲氨基嘌呤和细胞松弛素B刺激小鼠卵母细胞,比较卵母细胞的激活率和体外发育情况。结果表明,乙醇+6-DMAP+CB和A23187+6-DMAP+CB激活获得的激活率、桑囊胚率较高。     

Effects of Chemical Activation on the Parthenogenetic Development of Porcine in vitro Maturation Oocytes

The objective of this study was to determine the effects of ionomycin combined with cytochalasin B (CB), cycloheximide (CHX), or 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) on the activation of porcine oocytes. In Experiment 1, in vitro matured oocytes were activated with 15,20,25 or 30 mmol L-1 ionomycin separately. Activation rates of 20,25 mmol L-1 and 30 mmol L-1 treatments were higher (P<0.05) than that of 15 mmol L-1 treatment. In Experiment 2, in vitro matured oocytes were activated with 20 mmol L-1 ionomycin for 10,20,30,40 or 50 min and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 6 h.Cleavage and blastocyst rates [(72.40±13.02)％, (25.37±11.43)％] after treatments for 40 min were higher (P>0.05) thanthose of the other treatments. In Experiment 3, matured oocytes were activated with ionomycin and then incubated with 7.5 mgmL-1 CB, 10 mg mL-1 CHX, 2 mmol L-16-DMAP, 7.5 mg mL-1 CB + 10 mg mL-1 CHX or 7.5 mg mL-1 CB + 2 mmol L-1 6-DMAP for6 h. The rates of activation, cleavage and blastocyst of 2 mmol L-1 6-DMAP treatment [(86.05±4.29)％, (61.77±8.10)％ and(21.62±3.31)％] were higher (P<0.05) than those of 7.5 mg mL-1 CB treatment. In Experiment 4, matured oocytes wereactivated with ionomycin and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 3.5, 5.5 or 7.5 h. Cleavage rates and blastocyst rates of 5.5 h treatment [(66.59±14.36)％ and (25.40±10.16)％] were higher (P>0.05) than those of other treatments. In conclusion, activation of porcine oocytes appears to be most successful using the combination of ionomycin (20 mmol L-1,40 min) followed by 6-DMAP (2 mmol L-1, 5.5 h).     

化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

利用电极盘进行猪卵母细胞电激活

[目的]研究不同电激活参数以及电脉冲联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活效果的影响。[方法]使用电极盘,测定不同场强（1．1、1．3、1．5、1．7、1．9kV／cm）,不同脉冲时程（30、50、70、90、110ps）,1次脉冲下猪卵母细胞囊胚率的变化。[结果]结果表明,脉冲强度以1．5和1．7kV／cm效果最好,在80胂时其猪卵母细胞囊胚率分别达到（22．35±5．16）％和（20．59±9．41）％;脉冲强度1．5kWcm,1次电脉冲后4h联合6-DMAP激活卵母细胞,当脉冲时程达到70和90μs时,囊胚率分别达到（21．65±9．95）％和（23．10±16．27）％。[结论]在试验条件下,使用电极盘的最适电激活参数为脉冲强度1．5-1．7kV／cm,脉冲时长80μs,1次脉冲电激活。     

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的:探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法:兔超排后获得卵母细胞体外成熟22~24 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5~7 d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果:卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率(73.7%)显著高于乙醇+6-DMAP处理组(38.5%,P<0.05);与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论:激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。     

绵羊精子提取物对卵母细胞的孤雌激活作用

研究了绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞的孤雌激活作用,确定了绵羊精子提取物的最佳注射剂量,并将其孤雌激活效果与离子霉素联合6-DM AP法的激活效果进行了比较。结果表明,绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞有孤雌激活作用,最佳注射剂量为每个绵羊卵母细胞注入2~4 pL浓度5~6 m g/mL的绵羊精子提取物;绵羊精子提取物的孤雌激活效果与离子霉素联合6-DM AP法的激活效果差异不显著。