家兔胚胎细胞核移植的研究

兔超排后收集卵母细胞和１６细胞胚，以Ｍｃ－Ｇｒａｔｈ－Ｓｏｌｔｅｒ和Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ两种去（注）核方法，将１６细胞胚细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内，经体外培养或中间受体培养，使移核胚发育．结果表明：（１）兔胚核移植中上述两种去（注）法的成功率无差异；（２）ｈｃＧ注射后１３～１５ｈ，６７．８％的卵母细胞保留有第一极体；（３）强度为０．６３ｋＶ／ｃｍ，持续１６０μｓ的一次电脉冲可使７０．８％的注核胚融合，同样的电脉冲刺激卵母细胞的活化率为６１．１％；（４）兔移核胚在中间受体内或体外均可发育，在中间受体内有２３．０％可以发育到桑椹胚或囊胚．     

小鼠电融合胚胎发育影响因素的研究

电融合技术，是获得四倍体胚胎的主要手段．本试验研究了各种不同因素，对小鼠电融合胚发育的影响．结果表明，电刺激前后，使用不同的操作液对融合胚发育有影响．电刺激前使用Ｍ２液、电刺激后在Ｗｈｉｔｔｅｎ氏液中融合，然后转入ＣＺＢ液中培养，这一操作体系（Ｍ／Ｗ—ＣＺＢ）效果最好，融合胚的囊胚发育率为８０．５％，显著高于Ｍ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—Ｗ，Ｗ／Ｗ—ＣＺＢ组，后者的囊胚发育率分别为０，０，５４．５％（Ｐ＜０．０５）．试验还发现，刺激强度为１．０ｋｖ／ｃｍ，８０μｓ；１．０ｋｖ／ｃｍ．４０μｓ和０．８ｋｙ／ｃｍ，８０μｓ时，融合囊胚的发育率分别为７９．０，８１．９和７１．１％．ＨＣＧ注射后４７ｈ、４８ｈ的２—细胞胚胎的融合胚发育率，显著高于（Ｐ＜０．０１）ＨＣＧ注射后４２ｈ、４４ｈ和４６ｈ的，囊胚发育率分别为８２．９，８０．６，０，０和２２．８％．     

小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电泳冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外工观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，（１）以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５％／ｍｍ，脉０宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电脉冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外培养并观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，①以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞，激活卵的桑椹胚最高发育率为６９％．②用７％酒精刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％．     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵母细胞电激活的主要参数，初步建立了电激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多而升高，含Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电脉冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、卵裂率、囊胚发育率分别为８６．０％，８６．５％及４８．９％     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼核型及DNA含量的比较研究

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。尼罗罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。经流式细胞仪测量外周血红血球的ＤＮＡ含量，奥利亚罗非鱼为２Ｃ＝２．２２ｐｇ（２．２２ｐｇ／Ｎｕｃｌ）；尼罗罗非鱼为２Ｃ＝２．２７ｐｇ（２．２７ｐｇ／Ｎｕｃｌ）。经对比分析，两种鱼     

电磁场对绿豆萌芽的超弱发光和腺苷三磷酸的影响

本文报道了１０００ｖ／ｃｍ，５００ｖ／ｃｍ静电场和０．１Ｔ，０．２Ｔ恒磁场对绿豆萌芽的超弱发光强度以及腺苷三磷酸含量的影响及其机理。     

不同发育时期鼠胚对一步细管内冷冻一解冻耐受性的研究

本试验采用一步添加防冻剂（１０％甘油）、１２．５％蔗糖一步细管内脱除甘油，３７℃温水快速解冻法，对３９３枚处于不同发育时期的优良胚胎做了冷冻研究，旨在探索不同发育时期的胚胎对一步细管内冷冻解冻耐受性存在的差异，为哺乳动物胚胎冷冻和移植提供资料。解冻后体外培养结果表明，晚期桑椹胚（包括致密桑椹胚和致密后桑椹胚两个阶段）的抗冻能力最强，体外发育率致密桑椹胚为８０．０％（３２／４０）、致密后桑椹胚为７８．０％（３２／４１）；早期桑椹胚和早期囊胚次之，体外发育率为６２．２％（２８／４５）和６６．１％（３９／５９）；囊胚和扩展囊胚的抗冻能力最低，体外发育率仅为５１．６％（３１／６０）和５４．５％（１８／３３）。     

牛卵母细胞电激活参数的研究

分析了影响牛体外成熟卵细胞激活的主要参数，初步建立了激活的实验程序。结果表明，卵母细胞激活率随着卵龄的延长、电场强度的增加以及电脉冲次数的增多百升高，含Ｃａ６２＋、Ｍｇ＾２＋离子的电激液显著高于非电解质液。以０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋１００μｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２＋１００μｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２为电激液，施加１．６ｋＶ／ｃｍ、１６０μｓ，３次电泳冲间隔１５ｍｉｎ，激活率、裂率、囊胚发育分别为８６．０％     

雷竹地下鞭的系统结构

对雷竹地下鞭进行调查研究的结果表明：①雷竹地下鞭鞭段数为５．６条／ｍ￣２，鞭长为９．６ｍ／ｍ￣２，体积为４．７×１０￣（－４）ｍ￣３／ｍ￣２。在土中分布可深达６０ｃｍ，１１～４０ｃｍ之间占８０．０％以上，其中２～４龄鞭占总鞭数的８５．０％。②壮芽占总芽数的３１．１％，集中着生在３～４龄鞭上，发笋能力以３～４龄最强，占当年发笋总数的７０．０％～８０．０％；③壮芽和发笋位置在鞭段中部最多，６～１５节壮芽占５８．７％，发笋占７０．１％，岔鞭多发生在鞭段前梢，在１～６节占６７．０％；④鞭的延伸方向以平行林地和向上生长的类型为多，约占８０．０％以上，向上坡伸展的在５０．０％左右，向下坡伸展甚少；⑤以土壤肥沃深厚、疏松通气、蓄水保肥性能良好的竹林地鞭量较多，分布结构合理；⑥立竹１０００～１１００株／１０００ｍ￣２的竹林，地下鞭结构最适宜；随着发育年龄的增大（１２年生以上），壮龄鞭和壮芽渐减，老鞭增多。     

双亚5号亚麻与罗布麻原生质体解离及体细胞杂交

[目的]探索双亚5号亚麻与罗布麻原生质体制备、电融合和培养的适宜条件,为进一步深入进行亚麻与罗布麻体细胞杂交育种研究奠定基础.[方法]以已建立的双亚5号亚麻和罗布麻胚性细胞悬浮系为材料,制备原生质体并进行电融合,培养.[结果]制备亚麻和罗布麻原生质体的最佳渗透剂分别是5.6;蔗糖和0.7 mol/L甘露醇;游离亚麻和罗布麻原生质体的最适酶组合都是0.5; Cellulase Onozuka R-10+1.0; Cellulase Onozuka RS+0.2; Pectolyase Y-23;最佳酶解时间分别是4和3 h;亚麻细胞最佳继代时间是转瓶后的第3 d,在此条件下原生质体存活率均为92.0;,产量分别达到1.24×106和22.4×106个/mL;2种原生质体电融合的最佳参数依次为:AC 8 v/cm,持续25 s-DC 1 500 v/cm,脉冲宽度为60 μs,脉冲次数1次-交流电时间为9 s,重复次数2次.在此条件下融合率达到20.5;.[结论]亚麻与罗布麻原生质体在一定的条件下可实现体细胞杂交.     

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

小鼠胚胎嵌合的研究

选用昆白.CI_(57)及B/L_(615)三个品系小鼠,对其8细胞期(8C),桑椹期(M)和囊胚期(B)的全胚和半胚(半)进行聚合,培养和移植试验。8细胞期及桑椹期胚胎的聚合发育率显著高于囊胚期(P<0.05),全胚聚合的发育率显著高于半胚(P<0.05)。将同品系和不同品系的8细胞期,桑椹期和囊胚期胚胎嵌合移植给27只受体,9只妊娠,妊娠率分别为17％(1/6),40％(6/15)及33％(2/6),平均为33％(9/27),共产仔35只,其中不同品系胚胎的嵌合胚移植,产仔15只,4只为皮毛嵌合体。     

绵羊胚胎细胞核移植的研究

采用国产药品和试剂对绵羊进行超数排卵和胚胎细胞核移植。以 McGrath Solter 和Willadsen 两种去(注)核方法,将8-细胞胚胎细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内,并经琼脂包埋和中间受体培养,使移核胚胎发育。实验结果表明:(1)用国产激素和化学药品进行绵羊胚胎细胞核移植可使移核胚胎在中间受体内发育为囊胚或桑椹胚;(2)去核时卵母细胞质剩得过少可导致移核胚过早(6-细胞期)发生致密化或形成内细胞团细胞数目较少的小囊胚;(3)Willadsen 去(注)核方法的去核和注核操作成功率明显优于 McGrath-Solter 方法;应用McGrath Solter 法的去核率仅为60%;(4)强度为0.63KV/cm,持续160微秒(μs)的一次电脉冲获得的胚胎融合率最高,达71.2%;以同样电场条件刺激未去核卵母细胞的孤雌活化率在71.4%。     

家兔原核期受精卵的体外培养

原核期兔胚胎用微滴法分别在mDM液、TCM-199液和PBS液中进行培养,结果表明,发育到二细胞的百分率分别为96.95％(127/131),77.19％(44/57)和72.31％(47/65);发育到四细胞期的百分率分别为95.42％(125/131),64.91％(37/57)和63.08％(41/65);发育到八细胞期的百分率分别为84.73％(111/131),33.33％(19/57)和41.54％(27/65);发育到桑椹胚的百分率分别为67.94％(89/131),19.29(11/57)和23.08％(15/65)。以上结果说明:上述3种培养液中,改良DM液是把兔胚胎从原核期培养到桑椹胚的最佳培养液。     

山羊2-细胞胚胎的电融合试验

对山羊2-细胞胚胎的电融合参数进行了研究。结果表明,从融合率、卵裂率、胚胎死亡率三个指标综合衡量,电场强度1.2kV/cm,脉冲时程40μs是适宜的参数。     

小鼠卵母细胞的电激活及胚胎电融合

为提高核移植的效率，采用SHIMADZU生产的SSH－2电融合仪进行小鼠卵母细胞电激活及2－细胞胚胎电融合，结果表明：（1）不同脉冲的卵激活率有极显著差异（P＜0．01），在2次脉冲和30μs的脉冲宽度的条件下，脉冲强度以0．1kV/cm最好，激活率达76．9％；（2）不同脉冲强度、脉冲次数和脉冲宽度的胚胎融合率亦有极显著差异（P＜0．01），最佳融合参数为0.1kv/cm,30μs的脉冲宽度及2脉冲，胚胎融合率达84．6％。     

Factors Affecting the Efficiency of Embryonic Cell Nuclear Transfer in Rabbits

Factors affecting the efficiency of nuclear transfer （NT） in rabbits were examined in the present study. When 100 V mm of pulse strength and 15 us of pulse duration were employed, 3 and 4 electronic pulses resulted in significantly more cytoplasts fused with donor cells compared with 2 electronic pulses （P〈 0.05）, but no significant difference was found in the cleavage rate of reconstructed embryos among the three groups （P〉0.05）. When the duration and number of electronic pulse were fixed at 15 ps and 3 times, increase of pulse intensity from 100 V mm 1 to 150 V mm^-1 and 200 V mm^-1 resulted in a significantly decrease in the cleavage rate of reconstructed embryos （P〈 0.05）, although the fusion rate did not significantly differ among the three groups （P〉 0.05）. Significantly more reconstructed embryos cleaved and developed to blastocysts when they were derived from donor embryos at the 8-16-cell stage, in comparison with the reconstructed embryos derived from donor embryos at the compact morula stage （P 〈 0.05）, although the fusion rate was similar （P 〉 0.05）. Activation of cytoplasts prior to fusion increased the cleavage rate （P〈 0.05） and blastocyst development （P〈 0.05） of reconstructed embryos, but decreased the fusion rate （P 〈 0.05） compared with cytoplasts activated post fusion. More reconstructed embryos developed to blastocysts when they were cultured in TCM ＋ 3% OCS at the first 48 h and then cultured in TCM199＋ 10% FCS, in comparison with the reconstructed embryos cultured in either TCM199＋ 10% FCS or TCM199＋3% OCS （P 〈 0.05）. When 22 NT embryos were transferred into the oviducts of one recipient rabbit, one recipient rabbit delivered a female rabbit at 34 days of gestation. In conclusion, either electrofusion parameter or developmental stage of donor embryos have a significant effect on the efficiency of NT, NT embryos require different concentration of serum at their different development stages.     

山羊转基因克隆胚在体内和体外发育的研究

探讨了体内/外成熟卵母细胞、体内/外培养系统、输卵管液和输卵管上皮细胞共培养系统对转基因克隆胚发育的影响。结果表明:体内/外成熟卵母细胞对转基因克隆胚各阶段发育率无显著影响。体内/外培养系统中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率差异不显著;16-细胞和桑/囊胚发育率差异显著。对照组和20%输卵管液中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率均显著高于50%输卵管液;在20%输卵管液中16-细胞的发育率显著高于对照组和50%输卵管液。转基因克隆胚在输卵管上皮细胞共培养系统和SOF培养系统中培养,2～3-细胞和4-细胞发育率无显著差异;8-细胞、16-细胞和桑/囊胚的发育率差异显著。