新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度。结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰。综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰。     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

重组菌丝霉素在毕赤酵母中的分泌表达及活性研究

为获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌并探讨菌丝霉素的活性,将优化的目的蛋白碱基序列与标签MBP基因序列融合,通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA表达载体上并进行连接反应。取10μL连接产物转化至感受态细胞,挑取含Zeocin(25 mg/L)平板筛选出的单菌落进行PCR鉴定,将阳性克隆送往测序公司测序。对鉴定正确的含有重组质粒的大肠杆菌DH5α进行活化培养并提取其质粒,得到的重组质粒进一步线性化和纯化,并电转入GS115感受态细胞中筛选出阳性克隆,诱导分泌蛋白,对其进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定,得到的重组蛋白为55 Ku左右,浓度为700 mg/L,纯度达到80%以上。质谱鉴定结果表明,蛋白序列的覆盖率达到98%,纯化后的蛋白也对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,成功构建出一株能够分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌,这为菌丝霉素的工业化生产和研发新型绿色的饲料添加剂奠定了基础。     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检测两株单克隆抗体识别的抗原表位关系。SDS-PAGE和Western blot结果表明重组蛋白ORF2得到高效表达;筛选获得两株稳定分泌抗ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3H3和3F2,其分泌的单体均为IgG1亚型;且均具有较高的特异性和敏感性;叠加ELISA显示,两株单克隆抗体识别不同的抗原表位。本研究制备的单抗有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速准确诊断方法的建立提供了平台。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]当前,新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的疫情在全球大流行,严重危害人类的生命健康.研究拟制备并鉴定针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)的单克隆抗体,为SARS-CoV-2新型快速检测方法的创制奠定基础.[方法]纯化原核表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫后将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并通过western blot和间接免疫荧光试验鉴定抗体的反应性.[结果]经3次亚克隆,试验获得了2株能够稳定分泌抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D11和8G6;并且制备的抗体与真核表达的SARS-CoV-2 N蛋白反应原性良好.[结论]研究制备的单克隆抗体能够用于SARS-CoV-2的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

血红铆钉菇免疫调节蛋白基因克隆及其生物信息学分析和重组表达

为研究血红铆钉菇中克隆的一种新型真菌免疫调节蛋白基因以及其在毕赤酵母GS115中进行高效重组表达,采用同源克隆的方法从血红铆钉菇菌丝体基因组DNA中扩增得到一个新的真菌免疫调节蛋白基因——FIP-cru,构建FIP-cru真核表达重组载体,并在毕赤酵母GS115中进行FIP-cru重组表达。利用硫酸铵沉淀、琼脂糖镍纳米磁珠纯化目的重组FIP-cru蛋白,采用SDSPAGE和Western blot验证重组FIP-cru表达情况。利用体外血细胞凝集实验与MTT法检测r FIP-cru生物学活性。结果表明:FIPcru属于真菌免疫调节蛋白家族,包含342 bp,编码113个氨基酸,经生物信息学分析发现,FIP-cru与其他真菌免疫调节蛋白有较高的同源性。SDS-PAGE和Western blot检测表明FIP-cru在毕赤酵母GS115中正确重组表达,粗蛋白表达水平为148.5mg·L-1。纯化后的r FIP-cru可以在体外凝集小鼠和羊的血细胞而不凝集人血细胞,MTT法表明r FIP-cru可明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。FIP-cru为一种新型真菌免疫调节蛋白,毕赤酵母高效重组表达的r FIP-cru具有良好的生物学活性。     

抗Luman募集因子N端单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗Luman募集因子N端(Luman-recruiting factor N terminal,LRF-N)蛋白的单克隆抗体。【方法】PCR扩增LRF-N端的194bp序列,构建LRF-N重组质粒pGEX-LRF-N,转染BL21(DE3)菌,诱导表达并纯化GST-LRF-N融合蛋白,以其作为抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次,每次间隔10d,第4次加强免疫3d后采取小鼠脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞融合,用ELISA和Western blot进行阳性细胞株的筛选和鉴定,对获得的杂交瘤细胞的细胞核型、分泌稳定性以及所分泌的单克隆抗体进行鉴定。【结果】pGEX-LRF-N在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,GST-LRF-N蛋白分子质量约为33ku,与预期结果一致。试验共获得3株稳定分泌抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2AC9、2AG10和3G7。单抗2AC9、2AG10、3G7能够特异性地识别GST-LRF-N蛋白,亚型鉴定结果显示,其重链分别为IgG2a、IgM和IgG1。【结论】获得的抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株2AC9、2AG10、3G7单抗特异性良好,能够稳定分泌抗体,可用于小鼠LRF蛋白生物学功能及活性的进一步研究。     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。     

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。     

猪轮状病毒DN30209株VP4全长蛋白表达及多抗制备和鉴定

为开展猪轮状病毒（PRV）及其VP4蛋白相关特性研究,参照GenBank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-pGEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1??105,间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western blot）检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。     

鉴别伪狂犬病病毒强、弱毒株单克隆抗体的制备

用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV—FA)免疫Balb／c鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经间接ELISA筛选，获得11株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中6株仅与强毒FA反应，而不与弱毒FB、Bartha及gE缺失疫苗株发生反应。特异性鉴定结果表明，各株单抗均不与猪瘟病毒、猪流感病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应。     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的单克隆抗体(Mab),以原核表达的融合蛋白GST-N为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,利用重组蛋白His-N和Vero细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得3株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(5B2,3H1和4H5),单抗亚型鉴定均为Ig G1,轻链均为Kappa链。Western blot和间接免疫荧光试验结果表明,Mab能够识别重组N蛋白和PEDV。制备获得3株稳定性好、特异性强的Mab,可为今后建立检测猪流行性腹泻特异性诊断方法和研究PEDV核衣壳蛋白功能奠定基础。     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。