鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

淀粉卵甲藻的危害与诊治

近年来，由于大黄鱼高密度非规范化养殖，海水污染等造成水质严重恶化，不少养殖户利用海区围垦池塘网箱养殖大黄鱼，因池塘内水体交换少，水流小以及其它外界因子的影响，易造成淀粉卵甲藻的大量繁殖，导致对大黄鱼等养殖鱼类的严重危害，现报告闽东地区发生的病例。１　病原　病原为眼点淀粉卵涡鞭虫（Ａｍｙｌｏｏｄｉｎｉｕｍｏｃｅｌｌａｔｕｍ），属于肉鞭动物门、鞭毛亚门、植鞭纲、腰鞭目、胚乳科。该虫的营养体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ，ｔｒｏｐｈｏｎｔ），初期为梨形，后期则近于球形，大小为２０～１５０μｍ，最大的达３５０…     

不同来源嗜水气单胞菌的抗菌素耐药性及耐药机制分析

分离、收集不同时期来源于俄罗斯及国内各地的40株嗜水气单胞菌,常规生理生化鉴定结果表明这些菌株均为嗜水气单胞菌。9种抗菌素药敏纸片对全部菌株的测定结果显示,菌株的耐药强度与原分离地是否使用抗菌素高度相关。质粒与菌株耐药相关性分析结果表明,12个具有1个以上多拷贝质粒的菌株中,有11株呈现高度耐药性,提示耐药性与多拷贝质粒存在相关性;但无质粒或仅有低拷贝质粒的菌株,其耐药性强弱与质粒无相关性。菌株耐药稳定性试验结果证明,4℃条件下长时间保存会降低菌株的抗性,而连续多次冻存、复苏传代对菌株的抗性无影响。     

嗜水气单胞菌ZN1攻击鳗鲡后的组织病理观察

采用1/2半致死剂量的嗜水气单胞菌ZN1对鳗鲡进行腹腔注射,在第0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d采集鳗鲡肝、脾、肾、肠,观察鳗鲡经嗜水气单胞菌活菌攻击后各脏器的组织病理变化及脏器的损伤修复情况。结果显示,嗜水气单胞菌活菌ZN1攻击后鳗鲡肝、肾、脾、肠等组织细胞均出现程度不同的病变,且持续时间长达14 d以上,同时血液中的血栓细胞急剧减少,甚至全部消失。上述结果表明嗜水气单胞菌攻击后可引发鳗鲡各脏器发生明显的病理变化,并提示在病原菌攻击引起鳗鲡血栓细胞的减少并恢复缓慢可能是嗜水气单胞菌导致宿主产生败血症状的重要病理机制。     

嗜水气单胞菌β-hemA重组菌表达产物ISCOMs的研制

嗜水气单胞菌β-hemA重组菌PCB的培养上清液经硫酸铵梯度沉淀粗提毒素蛋白质,并在pH 2.5的柠檬酸缓冲液里酸化处理以暴露其疏水区,经Mega-10裂解后与Quil A结合制备ISCOMs,电镜下可观察到30～40 nm的多面体的笼格状颗粒结构.经鳗鱼的免疫保护试验证实,ISCOMs组(每尾40～80 μg)保护率高达100%,同剂量的溶血素+弗氏佐剂组可达62.5%,未加佐剂的溶血素只有50%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。     

Ⅱ耆水气单胞菌β-hemA重组菌表达产物ISCOMs的研制

嗜水气单胞菌β-hemA重组菌PCB的培养上清液经硫酸铵梯度沉淀粗提毒素蛋白质，并在pH2．5的柠檬酸缓冲液里酸化处理以暴露其疏水区，经Mega-10裂解后与QuilA结合制备ISCOMMs，电镜下可观察到30～40nm的多面体的笼格状颗粒结构。经鳗鱼的免疫保护试验证实．ISCOMs组(每尾40～80μg)保护率高达100％，同剂量的溶血素 弗氏佐剂组可达62．5％，未加佐剂的溶血素只有50％。     

刺激隐核虫在褐牙鲆上的传代及其生活史观察

为保存从福建省长乐市褐牙鲆上分离的刺激隐核虫、并了解其生物学特性、以褐牙鲆为宿主鱼、在水温 22~24益时、对刺激隐核虫进行传代、详细观察其生活史及各阶段的形态结构、比较不同温度处理的包囊孵化率和孵 出幼虫的感染能力、分别采集感染后2 周和4 周的褐牙鲆血清做阻动试验。目前已成功进行了40 个周期的刺激隐 核虫传代保种、每个周期8~10 d、表明褐牙鲆可作为刺激隐核虫的模式宿主鱼。观察包囊的形态结构、发现少数包囊 中存在疑似滋养体并做旋转运动的圆形原生质体。包囊5益冷藏2 个月后刺激隐核虫的孵化率下降至7.6 %、用 1 000 个5益冷藏后孵化的幼虫感染褐牙鲆、未检出滋养体。免疫血清阻动试验表明、感染后2 周和4 周的褐牙鲆血 清对幼虫的阻动效价分别为1颐320 和1颐1 280、说明体液免疫在抵抗刺激隐核虫的感染中发挥了重要作用。