环介导等温扩增技术及其在动物疫病检测中的应用

环介导等温扩增（LAMP）是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有高特异性、高灵敏度、简便快捷、成本低廉等特点,受到越来越多兽医工作者的关注。目前,该方法已经广泛应用于各种病原微生物的检测。本文就环介导等温扩增技术的原理、方法、应用等方面进行简述,最后指出LAMP当前存在的一些不足之处,并对其发展前景进行了展望,以期为其临床应用提供理论依据。     

乌头碱抗血清制备与鉴定

通过活性酯法将小分子的乌头碱(ACO)偶联到牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)上,形成偶联物ACO-BSA、ACO-OVA。以ACO-BSA为免疫原,ACO-OVA为检测原,通过ELISA法检测ACO-BSA免疫鼠血清效价,间接竞争ELISA法检测抗体特异性、最低检测限。结果表明,免疫原和检测原均偶联成功,血清效价均大于12 800。间接竞争ELISA法检测结果表明,所获抗体对ACO特异性强,最低检出限为1 ng/m L,IC50值为30 ng/m L,检测范围为1~6μg/m L。     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

为建立鸭H9N2亚型禽流感病毒的监测及临床诊断方法,根据鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以鸭源H9N2亚型禽流感病毒基因组为模板,建立鸭源H9N2亚型禽流感病毒的特异性RT-PCR检测方法,并用该方法对江苏省多地采集的疑似病料进行检测,扩增产物经测序鉴定后判断建立的方法对临床样品的检出率。结果显示,该方法可以特异性扩增鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因保守区的837 bp的序列,与对照的病毒无交叉反应,敏感性较好,最低可检测1fg基因组,临床样品的检测率为100%,表明本试验建立的鸭源H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭源H9N2亚型禽流感病毒感染。     

抗鹅α-干扰素单链抗体基因扩增与表达

为制备抗鹅α-干扰素的单链抗体,以抗鹅α-干扰素的杂交瘤细胞株总RNA为模板,RT-PCR法扩增鹅α-干扰素的抗体轻、重链基因,再采用SOE-PCR法,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3为接头,组装出完整的鹅α-干扰素的单链抗体可变区片段(Sc Fv)基因,并将Sc Fv基因克隆到p GEMT-Easy载体中进行测序分析,将测序正确的Sc Fv基因片段克隆入p ET-30a载体中进行诱导表达。结果显示,成功组装了Sc Fv基因,其全长为726 bp,为VH-Linker-VL结构,其中VH长357 bp、VL长324 bp,成功表达了Sc Fv蛋白,大小为27 ku。     

京海黄鸡促性腺激素释放激素受体基因密码子特性分析

为了了解鸡促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)基因的密码子特性,以便于为GnRHR基因的表达选择合适的外源表达系统,本研究使用在线工具CUSP、CHIPS及CodonW软件对鸡GnRHR基因的密码子特性进行分析,并与鸡、模式动物基因组和其他动物GnRHR基因密码子特性进行比较.结果显示,京海黄鸡GnRHR基因的ENc值较小,具有较强的密码子偏好性,且偏好以G/C结尾的密码子, GnRHR基因CDS序列中,GC含量大于AT含量;CodonW软件计算结果表明,京海黄鸡GnRHR基因密码子中,密码子GCC、ATC、CTC、CTG、CGC、CGG、AGC、TCC和GTG(RSCU>2)偏好性较强,且均以G/C结尾.对31条鸡基因分析表明鸡偏好密码子中有12种G/C结尾的密码子.与大肠杆菌、酵母菌和小鼠基因组密码子使用频率比较显示,京海黄鸡GnRHR基因密码子偏好性与3种生物相差很大,不适合进行外源表达.与其他动物GnRHR基因密码子偏好性比较显示,禽类GnRHR基因偏好含有或以G/C结尾的密码子,而其他物种的GnRHR基因无强烈的偏好性.聚类分析结果表明,亲缘关系近的物种之间倾向于拥有相同的密码子偏好性.     

欧洲玉米种质BC8241Ht衍生系的SRAP多态性与亲缘关系分析

Analyzed and identified SRAP polymorphism and genetic relationship on derived lines from Europe maize germplasm BC8241Ht at DNA molecular level,27 SRAP primer combinations were used to amplify the genome DNA of 21 maize lines of including derived lines from BC8241Ht.Total of 275 SRAP bans were observed and 131 out of these(47.6%) were polymorphic,and the polymorphism indicated that 21 maize lines used in the present study had abundant genetic diversity.The cluster analysis based on SRAP markers showed that 10 BC8241Ht derived lines were clustered in one group,but they were further clustered in first or third sub-groups.The close genetic relationship existed in 10 derived lines from Europe maize germplasm BC8241Ht,but the genetic differences also existed each other in the derived lines.In the course of improving the germplasm and its derived lines,they should be avoided mixing with Lvdahonggu,Tangsipingtou,PN and Southwestern local germplasm,and it can be improved by introducing tropical,subtropical germplasm.     

新城疫病毒LaSota株的毒株复壮鉴定试验

将冻存已久的新城疫病毒LaSota株在鸡胚中连传5代,获得E1~E5代病毒,选取代表性的E1和E5病毒进行病毒生物学与免疫原性鉴定。通过透射电镜法观察病毒粒子形态,利用血凝试验测定病毒的血凝价,借助1日龄雏鸡脑内注射的致病指数、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间、鸡胚致病率、鸡胚半数感染量等指标判定病毒的毒力或致病率,以雏鸡免疫试验确定病毒的安全性与免疫原性。结果表明,引入的LaSota株经过复壮,无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面,均符合低毒力活疫苗株的要求,可以用作单联苗或多联苗的制备。