Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

猪圆环病毒2型特异性单克隆抗体的制备与鉴定(英文)

以人工合成PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100 000。Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核PCV2PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达ORF1-ORF2串联蛋白及PCV2全病毒细胞培养物反应;间接ELISA证明该单核可与ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析

【目的】为获得禽戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）中国分离株（CaHEV）ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析。【方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA 结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot 和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74-88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74-88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备

为了制备猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒,根据GeneBank上公布的PCV2d亚型HB-MC1株的序列和大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2d亚型ORF2基因,克隆到原核表达载体pET30a(+),获得重组表达质粒pET30a-Cap2d,将该质粒转化入Rosetta(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析,利用Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫原性,并利用电镜技术鉴定重组Cap2d蛋白形成的病毒样颗粒。SDS-PAGE结果表明PCV2d的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达;电镜下观察超声破碎后的上清中存在大量直径约17 nm的病毒样颗粒;Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验结果表明该可溶性蛋白可与猪PCV2阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。本研究为制备PCV2d亚单位疫苗和相关检测试剂盒奠定了基础。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

猪瘟E2基因多克隆抗体的制备及其特性分析

以CSFV FJ-1株为模板对猪瘟E2基因的主要抗原表位进行PCR扩增,得到大小为370bp的目的片段,将其连接到pET-32a表达载体,转化BL21后利用IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白成功获得表达,大小约33.5ku融合蛋白。利用Ni-NTA agarose纯化蛋白、重组蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,多克隆抗体效价经间接ELISA检测可高达1∶6400。Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性,试验结果表明已成功获得猪瘟E2基因的多克隆抗体且能识别CSFV FJ-1毒株。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株 ORF3的克隆及原核表达

为获得猪圆环病毒Ⅱ型 ORF3编码蛋白,研究该蛋白的特性及功能,根据 GenBank 数据库中PCVⅡ的基因组序列设计引物,利用 PCR 从病料基因组 DNA 中扩增 PCVⅡ河南地方株 ORF3,将其克隆至表达载体 pET 32a 中进行诱导表达,SDS PAGE 电泳检测重组蛋白表达情况,采用 Ni＋NTA 亲和纯化表达产物,透析复性后免疫日本大白兔制备多抗血清,并采用 ELISA 和 Western blot方法检测多抗血清的效价和特异性。结果显示,PCR 扩增获得全长315 bp 的 ORF3,重组质粒经测序和双酶切证实构建正确;SDS PAGE 结果显示,ORF3能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为30 ku,以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白具有较好的抗原性,制备的多抗血清抗体效价达1∶12800以上,抗体特异性高,能与表达的 ORF3编码蛋白结合。成功克隆了 PCVⅡ河南地方株 ORF3并实现原核表达,获得纯化的重组 ORF3编码蛋白。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。     

鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原,ORF4是PCV2中继ORF1,ORF2,ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386~565 nt）,并克隆到pGEX\|4T\|1表达载体上,构建pGEX\|4T\|ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后,将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST\|ORF4纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔,在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。SDS\|PAGE电泳检测结果表明,重组质粒成功表达了目的蛋白。ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12 800以上。Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性,获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST\|ORF4融合蛋白特异性反应。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。     

PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

利用基因克隆方法,将PCV2的ORF2基因PCR扩增并酶切后连入pET-32a载体,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定后,与PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化,并分别免疫仔猪以比较免疫效力。结果为PCV2的Cap蛋白得到正确表达,免疫保护性试验结果显示,相对于灭活抗原制备的疫苗,表达的Cap蛋白制备的疫苗具有更好的免疫原性和保护效力。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。