非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析

【目的】为获得禽戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）中国分离株（CaHEV）ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析。【方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA 结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot 和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74-88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74-88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组兔出血症病毒核衣壳蛋白(VP60)为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备抗衣壳蛋白的单克隆抗体,获得了2株能稳定分泌抗VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AE11和AH4).分别利用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)等方法对单抗的免疫活性和特异性进行检测,结果证明,此两株单抗均能识别重组的VP60和天然病毒的衣壳蛋白,而IFA结果显示只有AE11能和RHDV反应,可观察到强烈的特异性绿色荧光,表明成功制备了抗RHDV的VP60特异性单抗.     

ASFV解旋酶D1133L蛋白表达和抗体检测方法的建立及初步应用

为了建立快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的血清学方法,本研究原核表达了ASFV的D1133L重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并采用该方法检测了ASFV感染猪后D1133L的抗体应答情况.结果显示:成功表达纯化了D1133L蛋白,以此为抗原建立了ELISA抗体检测方法,该方法特异性高,灵敏性强,其检测结果与市售试剂盒检测结果的符合率达100％.家猪在感染ASFV后,针对D1133L的抗体在第5天可被检测到,在第7天抗体水平达到顶峰.     

ASFV解旋酶D1133L蛋白表达和抗体检测方法的建立及初步应用

为了建立快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的血清学方法,本研究原核表达了ASFV的D1133L重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并采用该方法检测了ASFV感染猪后D1133L的抗体应答情况。结果显示:成功表达纯化了D1133L蛋白,以此为抗原建立了ELISA抗体检测方法,该方法特异性高,灵敏性强,其检测结果与市售试剂盒检测结果的符合率达100%。家猪在感染ASFV后,针对D1133L的抗体在第5天可被检测到,在第7天抗体水平达到顶峰。     

鸡NLRX1受体基因的原核表达及抗体制备

NLRX1(NLR family member X1)是一种调控天然免疫应答的重要模式识别受体。首先应用PCR方法分别对鸡NLRX1基因的编码区和N端1～492 bp截短序列进行PCR扩增并克隆到原核表达载体p ET-32a(+),以IPTG诱导重组菌表达,获得了重组NLRX1蛋白和N端截短表达蛋白(r NLRX1-part)。其次将纯化的截短重组蛋白r NLRX1-part免疫新西兰兔,以间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测制备的抗体效价为1∶512 000。应用Western blot方法分析显示,该抗体不仅可特异性结合原核表达NLRX1蛋白也可有效识别鸡DF-1细胞中过表达NLRX1蛋白。     

非洲猪瘟病毒P30-54融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及反应原性研究

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。     

非洲猪瘟p62蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得非洲猪瘟(african swine fever virus, ASFV)p62蛋白进行血清学诊断技术研究。根据GenBank ASFV参考序列合成CP530R基因(编码p62蛋白),插入pET-32a(+)载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE及Western blot鉴定。采用Ni柱纯化p62蛋白,然后免疫Balb/c雌鼠,制备鼠抗ASFV p62蛋白的多克隆抗体,ELISA检测多抗效价。结果表明,成功构建了pET32a-p62质粒,表达蛋白为56.1 kDa,以包涵体表达为主。Western blot显示该蛋白能与ASFV阳性血清结合。Ni柱纯化获得p62蛋白浓度为2.9 mg/mL。用该蛋白免疫小鼠,三免后抗体效价达1∶256 000。表明表达蛋白具有良好抗原性,制备的p62多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究p62蛋白的特性和诊断奠定基础。     

支气管败血波氏菌截短BcfA表达的重组蛋白及其免疫活性分析

为提高支气管败血波氏菌保护性抗原BcfA重组蛋白的表达量和可溶性,对编码BcfA N端373位氨基酸残基之后的BcfA基因碱基序列进行了克隆和表达,截短后的BcfA表达量提高了10倍,且主要为可溶性表达.Western blot结果显示,截短BcfA表达后的重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清反应依然明显.免疫保护力试验结果表明截短BcfA表达的重组蛋白依然对支气管败血波氏菌表现出良好的免疫保护作用.     

非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备

为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。     

牛呼吸道合胞体病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立及应用

 【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)HJ株重组N蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。【方法】将已构建的重组菌BL21(DE3)进行诱导表达,获得重组N蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化,并用Western blot对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组N蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法。【结果】成功表达并纯化了BRSV HJ株重组N蛋白,Western blot检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组N蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。交叉试验结果表明重组N蛋白与牛无浆体病(Anaplasmosis)、牛传染性鼻气管炎(IBRV)和牛副流感(BPIV)阳性血清均不发生交叉反应。与中和试验(SNT)相比较,该方法的特异性、敏感性和符合率分别为85.0%、90.9%和87.7%。采用本试验建立的间接ELISA方法对黑龙江省的牡丹江、佳木斯、鹤岗和大庆4个地区牛场的600份牛血清进行了检测,结果表明,黑龙江省部分地区BRSV的抗体阳性率为27.33%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实黑龙江省部分地区存在牛呼吸道合胞体病。这一研究为牛呼吸道合胞体病诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4） Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化，截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段， PCR扩增其基因序列，连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化，并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株，再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统，获得大小约为67 kD的 Fiber-2截短蛋白，以包涵体的形式出现，经纯化后可获得单一的特异性条带，经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、 4F6、 5A5、 6G10和10B5），其抗体分泌稳定性、特异性好，诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400，腹水抗体效价为1:320000~1:1280000，秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、 4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链； 5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系 （LMH）进行IFA检测，结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。     

Development of a recombinant pB602L-based indirect ELISA assay for detecting antibodies against African swine fever virus in pigs

African swine fever (ASF), caused by the African swine fever virus (ASFV), is a devastating disease of domestic and wild pigs. There is no effective vaccine, and the control of the disease relies mainly on surveillance and early detection of infected pigs. Previously, serological assays, such as ELISA, have been developed mainly based on recombinant structural viral proteins of ASFV, including p72, p54, and p30. However, the antibodies against these proteins do not provide efficient protection against ASFV infection in pigs. Therefore, new serological assays that can be applied for clinical diagnosis and evaluating serological immune response in vaccinated pigs are still required. In this study, we expressed and purified a recombinant pB602L protein. The purified pB602L protein was then used as an antigen to develop an indirect ELISA assay. This assay has no cross-reaction with the anti-sera against the 15 most common pig pathogens in China, such as classical swine fever virus, pseudorabies virus, and porcine parvovirus. This assay and a commercial ELISA kit were then used to detect 60 field pig serum samples, including an unknown number of anti-ASFV sera. The coincidence of the two assays was 95%. Furthermore, the pB602L-based ELISA was employed to test the antibody responses to the seven-gene-deleted ASFV strain HLJ/18-7GD in pigs. The results showed that the antibody levels in all vaccinated pigs, starting from the 10th day post-inoculation, have increased continuously during the observation period of 45 days. Our results indicate that this pB602L-based indirect ELISA assay can be employed potentially in the field of ASFV diagnosis.     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

监测重组蛋白EgM9免疫犬的特异性抗体变化

[目的]探索EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律.[方法]利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG、IgGi,IgG2,IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证.[结果]经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1,IgG2,差异极显著(P <0.01),而特异性抗体IgA,IgM和IgE差异不显著(P > 0.05).[结论]证实EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答.     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

 【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis,HPS）外膜蛋白P5（outer-membrane protein P5,OMP5）,建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体 pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为 1:400,血清的最佳稀释度为1:160。用建立的间接ELISA 方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近。同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%。【结论】本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。