β-雌二醇和孕酮促进非洲猪瘟病毒体外复制

旨在探究雌二醇(β-estradiol,E2)和孕酮(progesterone,P4)对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)体外复制的影响。采集空怀猪血清(non-pregnant swine serum,NPSS)和怀孕猪血清(pregnant swine serum,PSS)处理后,用添加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、NPSS和PSS的培养液分别培养猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)并感染ASFV,利用绝对定量PCR和Western blot检测ASFV复制差异;用E2和P4 ELISA试剂盒检测各组血清中E2和P4含量;并在FBS组中单独或者混合添加E2和P4后感染ASFV,检测ASFV复制差异;用NPSS和PSS培养BMDM 24 h后,相对定量检测β-干扰素及下游抗病毒因子转录差异。PSS培养组ASFV复制高于NPSS培养组;PSS中E2和P4的含量均高于NPSS,且FBS中E2和P4的含量很低;在FBS组中单独或者混合添加E2和P4后ASFV复制量增加;PSS培养BMDM后会抑制β-干扰素及下游抗病毒因子的转录。PSS中高含量的E2和P4促进ASFV复制,本研究为解释临床上猪群感染非洲猪瘟(African swine fever,ASF)后母猪首先发病且怀孕母猪病情较重的现象提供一定的科学依据。     

三种型号ABS塑料对制作绵羊支气管动脉铸型标本的影响

探寻适宜于制备支气管动脉铸型标本的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)铸型剂材料。选用3种不同型号的ABS(PA-749SK、D-120、PA-717CK)对绵羊支气管动脉铸型标本的制作效果进行比较。结果表明,PA-749SK型ABS制备的铸型标本柔韧性和细密度较好;PA-717CK型ABS制备的标本表面光泽度好,但柔韧性和细密度较差;D-120型ABS制备的标本各项性能介于前两者之间。说明受试的3种型号ABS中,PA-749SK型号的ABS更适用于制作绵羊支气管动脉铸型标本,也可以作为其他细小管道的铸型材料被选用。     

甜菜碱对三元育肥猪血清中TP、BUN、IgG含量和ChE活性的影响

旨在研究饲粮中不同甜菜碱水平对三元育肥猪血清中TP、BUN、IgG含量和ChE活性的影响。选取60头3月龄左右、体重相近(49kg±4.04kg)的杜大长三元杂交育肥猪,随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮(无甜菜碱),试验组分别饲喂在基础饲粮中添加1 000、1 500、2 000mg/kg甜菜碱的试验饲粮。饲喂试验前后前腔静脉采集抗凝血液,分离血清,全自动生化分析仪测定血清中TP、IgG、BUN含量和ChE活性,应用SPSS23.0软件进行统计学处理与分析。结果表明,3个水平甜菜碱对三元育肥猪血清中BUN含量和ChE活性无显著影响(P0.05);3个水平甜菜碱可显著提高血清TP含量(P0.05);在1 500mg/kg甜菜碱水平下,饲喂前后TP与IgG含量变化与对照组相比极显著升高(P0.01);饲粮中甜菜碱添加量为1 500mg/kg时饲喂效果最好,可促进三元育肥猪蛋白质合成代谢、提高其免疫力,是育肥猪饲粮甜菜碱最适添加量。     

猪源组织蛋白酶S抑制O型口蹄疫病毒在PK-15细胞复制

前期研究数据表明组织蛋白酶S（cathepsin S，CTSS）在猪初乳中表达水平显著高于常乳，且CTSS有抑制病毒复制的作用，本研究旨在探究猪源CTSS对O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus serotype O，FMDV-O）复制及对FMDV诱导的抗病毒细胞因子的影响。FMDV-O感染PK-15细胞，利用RT-qPCR和Western blot分别在转录和翻译水平探究FMDV-O感染对内源性CTSS表达的影响；使用CTSS活性检测试剂盒测定FMDV-O感染对CTSS酶活性的影响；根据GenBank公布的CTSS基因序列（XM_021089893.1）构建CTSS真核表达质粒，利用脂质体方法转染PK-15细胞，通过Western blot检测CTSS表达情况，并在此基础上通过Western blot和RT-qPCR检测过表达CTSS对FMDV-O复制及FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子mRNA水平的影响；进一步针对CTSS设计合成3对特异性siRNA，利用Western blot和RT-qPCR检测CTSS和FMDV-O的变化。结果表明，FMDV-O感染PK-15细胞能显著上调猪源CTSS表达并增强CTSS酶活性；过表达CTSS能抑制FMDV-O在PK-15细胞中复制，这种抑制作用可能是通过促进FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子产生而发挥功能的；干扰序列siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进FMDV-O的复制。猪源CTSS促进宿主抗病毒细胞因子产生可能是抑制FMDV-O复制的原因之一，本研究为深入探究宿主CTSS在抗FMDV天然免疫应答中的作用及机制提供依据。     

非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

ASFV解旋酶D1133L蛋白表达和抗体检测方法的建立及初步应用

为了建立快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的血清学方法,本研究原核表达了ASFV的D1133L重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并采用该方法检测了ASFV感染猪后D1133L的抗体应答情况.结果显示:成功表达纯化了D1133L蛋白,以此为抗原建立了ELISA抗体检测方法,该方法特异性高,灵敏性强,其检测结果与市售试剂盒检测结果的符合率达100％.家猪在感染ASFV后,针对D1133L的抗体在第5天可被检测到,在第7天抗体水平达到顶峰.     

PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制

旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。     

羊传染性脓疱病毒感染山羊皮肤成纤维上皮细胞差异表达miRNA分析

旨在研究羊传染性脓疱病毒（orf virus，orfv）感染山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts cell，GSF）对GSF细胞microRNA（miRNA）表达谱影响，探究miRNA在orfv感染过程中的作用及调控机制。分别提取感染和未感染orfv的GSF细胞总RNA，构建miRNA文库，利用高通量测序技术进行miRNA差异表达分析，对差异表达miRNA靶基因进行预测，并进行GO和KEGG分析，随机选取10个差异miRNA进行RT-qPCR验证。结果显示，orfv感染组和未感染GSF细胞组相比共有678个显著差异表达的miRNA（fold change≥1.5），其中，上调表达miRNA有509个，下调表达miRNA有169个，uniq_miRNA的Venn图分析显示，感染组和对照组共有的miRNA仅占8.21%；GO和KEGG分析显示，差异表达miRNA主要参与脂质代谢、受体及细胞因子信号转导等细胞生物学过程，RT-qPCR验证结果与高通量测序结果一致。本研究结果表明，orfv感染GSF细胞对其编码的miRNA有显著影响，获得大量GSF细胞编码的与orfv感染相关的差异miRNA，为进一步从宿主miRNA层面揭示orfv感染和致病机制提供了参考依据。     

非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒（ASFV） D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根据GenBank公布的ASFV序列（LR743116.1）,合成D1133L基因并构建其重组真核表达质粒pCMV-D1133L,蛋白免疫印迹（Western blot,WB）验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,应用间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）研究了该蛋白的亚细胞定位。结果表明,通过ASFV解旋酶的基因系统进化树,发现5种解旋酶基因均相对保守。D1133L基因全长3 402 bp,表达的蛋白为124.63 ku,G+C含量为6.1%,A+T含量为10.6%;二级结构分析表明α螺旋占48.90%,扩展链占13.50％,无规卷曲为33.27%;三级结构分析表明六自由度结构（six degree of freedom,QMQE）为0.20,覆盖率84%,且预测以α螺旋为主的高级结构;通过LOCSVMPSI分析预测,显示D1133L蛋白定位于细胞核内与细胞质内的概率是相同的。WB结果显示pCMV-D1133L质粒正常表达,IFA试验证明ASFV编码的解旋酶D1133L同时分布于细胞核和细胞质。本研究通过对D1133L基因序列、结构功能预测,并通过IFA验证了D1133L亚细胞分布,为进一步揭示D1133L基因功能奠定了一定基础。     

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明：ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。