微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

[目的]提高国内Ⅰ群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止Ⅰ群禽腺病毒蔓延.[方法]优化Ⅰ群禽腺病毒的增殖条件,以Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAV-4)及血清8型(FAV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯(BPL)的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验.[结果]疫苗灭活以1.00 mL/L终浓度的甲醛或0.500 mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4 ℃下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100 μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250 μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数.[结论]FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化Ⅰ群禽腺病毒提供了技术支撑.     

禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽Ⅰ群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗.比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10％,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最...     

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好...     

血清4型禽腺病毒水平感染SPF鸡的致病性研究

为研究血清4型禽腺病毒(FAdV-4)通过水平传播途径感染SPF鸡的致病性，将3周龄SPF鸡饲养于FAdV-4不同污染程度的隔离器中以建立自然感染动物模型，每天记录疾病过程并统计发病率和死亡率，剖检并检测器官病毒载量，检测环境和鸡躯体表面的FAdV-4病毒载量。结果显示：FAdV-4水平感染SPF鸡的第1～4天无明显临床症状，第5天起饮食量下降、排黄绿色粪便，第6～9天陆续有鸡死亡，第10天后鸡群逐渐康复至与对照组相同；FAdV-4具有广泛的组织嗜性，在肝脏中含量最高；环境中FAdV-4的污染程度对鸡群的发病率和死亡率均有影响，每25 cm²地网的病毒载量为1.4×10⁵ copies、侧壁为2.3×10³ copies、料槽为1.2×10⁴ copies时将达到环境致病阈值，此时每25 cm²鸡体表病毒载量为脚底1.2×10⁵ copies、头部1.1×10⁴ copies、背部3.7×10³ copies。本...     

微滴式数字PCR定量检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)的方法，并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列，在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列，应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法，并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示，建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果，本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，且无交叉反应。灵敏性结果显示，本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线，其曲线呈良好的线性关系(R²=0.999 4),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测，结果...     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

心包积水-肝炎综合征转归的病理学观察

为研究心包积水-肝炎综合征（HHS）的转归，试验采用血清4型禽腺病毒感染4周龄SPF鸡，建立发病率为90%、死亡率为20%的动物模型，观察SPF鸡大体病变并采集肝脏、心脏、脾脏、腺胃、胰腺、肺、肾脏、法氏囊、胸腺、脑、肌肉、小肠、肌胃、食管和气管制作组织病理学切片，检测组织样本中的病毒载量。结果显示：心包积液完全吸收，腺胃出血消失，脾脏轻微肿胀，肝脏仍存在部分黄染和肿胀，组织学检查发现肺脏已完全恢复，肝脏、法氏囊、胸腺、脾脏仍存在组织变性坏死及广泛的炎性细胞浸润；转归期后器官的病毒含量均显著降低（P<0.05）。结果表明HHS的转归为不完全痊愈，对肝脏及免疫器官的功能将造成长期影响。     

FADV-4感染LMH细胞STING依赖的干扰素及细胞因子转录水平动态变化

为了探讨干扰素刺激基因(STING)依赖的干扰素及细胞因子在血清4型禽腺病毒(FADV-4)感染鸡肝癌细胞(LMH)后的表达量情况。试验将FADV-4感染LMH细胞，观察病变，收集感染后24,48,72,96,120 h的细胞样品，抽提RNA反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术监测FADV-4病毒复制情况及STING、TANK连接酶(TBK1)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素α(INF-α)、干扰素β(INF-β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素1β(IL-1β)基因表达量动态变化。结果表明：FADV-4感染LMH细胞24 h后，细胞开始出现病变迹象，随着感染时间延长，细胞出现变圆变亮、脱落、死亡等典型病变。病毒在24～48 h快速增殖，72 h出现增殖高峰(9.13×10¹⁰ copies/μL),96～120 h呈现下降趋势。与对照组相比，STING和IRF7的表达量在感染72 h后显著上调(P<0.05),96～120 h极显著上调(P<0.01);其中TBK1表达量在24～72 h上调，96～120 h下调；I...