鸡腺胃型传染性支气管炎病毒山东分离株S基因的克隆及序列分析

为研究3株鸡腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株(青岛腺胃株QX株、东营腺胃株DY株、肥城腺胃株FC株)病毒纤突蛋白基因(S基因)的核苷酸特征,与呼吸型M41标准株及肾型IBV进行S基因核苷酸进行同源性比较。采用RT-PCR技术方法,对IBV分离株(QX、DY、FC)及标准毒株M41株S基因进行克隆和序列测定,对其中QX和DY株S基因核苷酸分别用3种方法(Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method)对获得的基因核苷酸序列进行分析。结果显示,QX株和DY株的S基因核苷酸与标准毒株M41株S基因核苷酸的同源性最高为79.3%和79.2%,最小差异性为24.5%和22.3%。QX株和DY株与肾型IB分离株HD同源性最高为78.4%和78.9%,最小差异性均为22.7%。HD株与M41株的同源性最高达到80.8%。通过对S基因进化关系分析,说明腺胃型IBV山东分离株(QX、DY株)与呼吸型和肾型IBV是引起不同组织嗜性的IBV变异株,与呼吸型IBV和肾型IBV有明显的差异,是在IBV遗传变异进化过程中具有重要地位的进化阶段。     

乳酸菌微生态制剂对肉鸡生产性能及免疫机能的影响

本实验利用乳酸菌微生态制剂饲喂AA肉鸡,通过检测鸡增重、料重比、免疫器官指数、抗体效价以及盲肠内容物的乳酸菌和大肠杆菌数量,探索乳酸菌微生态制剂对肉鸡生产性能及免疫功能的影响。首先将150只肉鸡随机分成3组,第1组在饮水中添加0.3%的乳酸菌微生态制剂,第2组添加抗生素饮水,第3组为空白对照组,7日龄时接种新城疫疫苗;于每周末称取各组鸡的体重、耗料,计算增重和耗料量;在21日龄和35日龄时,采取各组鸡的脾脏、法氏囊和胸腺、分别计算免疫器官指数;用HI和微量平板滴种法分别检测抗体效价和盲肠内容物乳酸菌、大肠杆菌数量。结果显示,添加0.3%乳酸菌微生态制剂组与对照组和抗生素组鸡比较,分别提高鸡体重15.55%和8.57%(差异显著P<0.05),料重比分别降低5.11%和4.57%;于21日龄和35日龄时检测发现,添加0.3%乳酸菌微生态制剂组与对照组鸡比较,脾脏、法氏囊和胸腺指数分别提高了44.26%1、3.51%、33.96%和67.14%、16.47%3、8.16%;抗体水平分别升高了1.8log2和2 log2,差异显著(P<0.05),与抗生素组比较,抗体效价分别提高了1.4log2和1.75log2,差异显著(P<0.05);另外,21日龄和35日龄时,与对照组比较,添加0.3%乳酸菌微生态制剂鸡盲肠内容物中乳酸菌数量分别增加1.28log2和0.27log2,差异显著(P<0.05),同时分别使大肠杆菌数量减少1.88log2和0.84log2,差异显著(P<0.05)。本研究为合理开发利用乳酸菌微生态制剂提供了理论依据和技术支持。     

REV囊膜糖蛋白的表达、纯化及单克隆抗体的制备和初步鉴定

以禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的cDNA为模板,用PCR技术获得囊膜糖蛋白(env)基因的部分片段并构建了pGEX-4T-3-env表达质粒,进而在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白GST-env,SDS-PAGE证明表达的融合蛋白以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性、复性以及牛凝血酶酶切后得到纯化的目的蛋白env,免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb),并通过间接ELISA、间接免疫荧光和Western blotting等方法对mAb做初步鉴定。结果表明,试验成功表达了env蛋白,并获得了4株稳定分泌针对env蛋白的杂交瘤细胞(3-2A11,1-2B3,1-2D11,3D2),其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG2b,IgG2b,IgG2b,IgG1。ELISA检测,对应腹水的效价分别为1∶105,1∶2.1×105,1∶2.2×105,1∶105。Western blotting结果显示4株抗env的mAb均能特异性识别env蛋白,间接免疫荧光分析则表明只有3-2A11和3D2这2株mAb能与REV全病毒特异性反应。     

AA肉鸡补体C3d基因eDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的eDNA，从鸡肝细胞提取总RNA，通过RT—PCR扩增出C3d基因的eDNA，脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体，构建C3d—pMD18-T重组质粒，转化大肠杆菌，酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1．0kb左右的PCR扩增片段，序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT—PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA，为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

聊城市奶牛临床型乳房炎病原菌的分离鉴定

对聊城市郊区三个不同规模奶牛场的29头奶牛115份奶样进行病原菌的分离鉴定,共分离出10种110株细菌,链球菌29株占25.22%;葡萄球菌26株占22.61%;肠杆菌19株占15.65%;酵母菌18株占16.52%;棒状杆菌8株占6.96%.奶样病原菌阳性率为79.13%,奶样混合感染率为20%.确定聊城市奶牛临床型乳房炎主要由链球菌、葡萄球菌、肠杆菌和酵母菌引起.     

沙门氏菌invH基因的序列分析与分子检测

根据沙门氏菌的invH基因序列设计1对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株和5种非沙门氏菌株进行PCR扩增,结果3种标准沙门氏菌株均扩增出479 bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增。对3种标准株的扩增片段进行克隆及序列分析,证实沙门氏菌的invH基因序列比较保守;对19种地方分离沙门氏菌进行PCR特异性检测,结果有16株扩出特异性条带,表明本研究建立的沙门氏菌检测方法具有较高的特异性。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果，构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染COS-7细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠，检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

羔羊白肌病的综合防治

羔羊白肌病又称肌营养不良症、僵羊病，绵羊羔及山羊羔都可发生。其特征是心肌与骨骼肌组织发生变性，颜色变淡，甚至苍白，并发生运动障碍和急性心肌坏死，常呈地方性、季节性流行，若不及时采取有效措施进行治疗，死亡率很高。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

抗AIV(H9)独特型杂交瘤细胞株检测方法的建立

采用兔抗AIV IgG作为检测抗原,通过预试确定了包被抗原的工作浓度为800μg／mL,以间接ELISA 方法检测融合细胞培养上清液,筛选到产生抗AIV鸡和兔种间共有独特型抗体的杂交瘤细胞,间接ELISA试 验中P／N值达12,证明杂交瘤细胞分泌目的单克隆抗体旱现强阳性。运用该检测方法,排除了分泌抗鸡同种 型表位以及超变区其他表位抗体的杂交瘤细胞,从而为筛选分泌抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体的杂交瘤 细胞确定了可靠的方法。