绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5 000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

成都地区番茄越冬嫁接规模化育苗技术

正导读:成都地区冬季低温寡日照多,番茄嫁接苗易出现徒长等现象,番茄嫁接苗成活率低、商品性差,阻碍了成都番茄嫁接育苗规模化、产业化发展,在多年研究与探索的基础上,总结出一套成都地区番茄越冬规模化嫁接育苗技术体系,包括培育砧木、接穗壮苗,采用套管贴接法适时嫁接,科学精细管理嫁接苗,采用简易节能环保加温设施及技术等。     

一种防治农业害虫的新技术措施—频振式杀虫灯在广西的推广应用

频振式杀虫灯是诸多生态农业病虫防治技术中一项切实可行的技术措施 ,利用害虫的趋光波的特性来诱杀害虫。其杀虫谱广 ,诱杀效果好 ,应用范围广。可诱杀棉花、水稻、小麦、杂粮、豆类、蔬菜、仓贮、果树、烟草等多种作物上的 1 2 70多种害虫。该灯的应用 ,减少了化学农药的使用 ,减轻农药对作物、环境的污染 ,延缓害虫抗药性的产生等 ,极有利于病虫无害化治理、生态农业的发展。全国农业技术推广服务中心已列入推广计划 ,并在新疆、河南、河北、山东、陕西、山西、湖北、江苏、安徽等省区大面积扩大应用 ,成效显著 ,有力地促进了生态农业病…     

表达A型产气荚膜梭菌FBA蛋白的延迟裂解型沙门菌载体的构建

利用PCR技术扩增FBA基因序列,并将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得pET-30a-FBA重组质粒。将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达His-FBA蛋白,通过His-tag Ni柱亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备FBA特异性多克隆抗体。再利用PCR技术将FBA基因与表达载体pYA3681连接,构建了表达载体pYA5129,电转至延迟裂解性沙门菌χ11802后以制备的FBA多抗为一抗进行免疫印迹试验,验证了其免疫原性;同时比较了不同浓度阿拉伯糖对重组沙门菌生长性能的影响,优化了阿拉伯糖最佳添加浓度,为后续研究其作为肉鸡坏死性肠炎疫苗的可行性奠定基础。     

不同影响因素对二嗪磷微乳剂物理稳定性的影响

采用直接观测外观和测定透明温度范围的方法,对微乳剂的基本组成成分一表面活性剂、助溶剂、水对二嗪磷微乳剂物理稳定性的影响分别进行了研究。对各因素从性质和用量两方面进行了探讨,并研究了无机盐(NaCl)浓度对微乳剂透明温度范围的影响。结果表明：表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)值在12～15之间、助溶剂为乙醇或甲醇时配出的微乳剂较好;不同水质均可配出外观均相、透明的微乳剂,但硬水对微乳剂的冷贮稳定性有一定的影响;NaCl质量分数≤0．5％时的微乳剂其透明温度范围在-5～60℃。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231～536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组...     

社区戒毒中的艺术干预心理辅导研究

艺术的怡情性已成共识。艺术干预心理辅导以艺术的形式关注社区毒瘾患者的心理健康,对毒瘾患者提供心理辅导。本文从社区戒毒的现状出发,尝试利用艺术的手段,丰富戒毒模式,增强毒瘾患者的戒毒信念,提高戒毒效果。     

非洲猪瘟病毒MGF505-3R蛋白的原核表达研究

为获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)体外诱导表达的MGF505-3R蛋白.实验依据GenBank中报道的MGF505-3R基因序列设计引物,引入His标签,以ASFV基因全序列为模板扩增目的基因.将目的基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,并转入大肠杆菌Transett...     

基于截短MOMP蛋白的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法的建立

为了建立检测绵羊流产衣原体MOMP(main outer membrane protein)蛋白抗体的间接ELISA方法,试验将编码MOMP蛋白的基因序列经密码子优化后进行基因合成,并克隆和原核表达截短蛋白,以该蛋白为抗原建立绵羊流产衣原体抗体的间接ELISA方法,优化该方法的反应条件,同时验证其特异性、敏感性和重复性,最后用该方法对临床待检羊血清进行检测,并与间接血凝试验试剂盒的检测结果进行比较。结果表明：截短蛋白MOMP_201～390的表达、纯化效果最好。经探索,优化后的间接ELISA方法最优反应条件：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃包被2 h,待检血清最佳稀释度为1∶100,血清和酶标二抗的最佳作用时间分别为45 min、60 min。建立的间接ELISA方法的敏感性较高,特异性和重复性较好,使用该方法从209份临床待检羊血清样本中检出47份阳性血清,与间接血凝试验试剂盒分别检测临床待检羊血清样本86份,总符合率为80.23%。说明基于截短蛋白MOMP_201～390建立的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法可用于绵羊流产衣原体临床血清...