猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。     

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

克隆了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CC-11株的N基因全序列,将其克隆至原核表达载体pET28a,转化E.coliRosetta株后经0.5 mmol/L IPTG诱导,获得了高水平表达。对表达的N蛋白进行纯化,以50μgN蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA筛选,获得9B12、7C2、7C6共3株稳定分泌抗PRRSV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,亚型鉴定结果分别为IgG2b、IgG1、IgG1亚型。通过Western blot分析和间接免疫荧光测定表明,3株单抗对PRRSV CC-11株、CH-1R和JXA1-R细胞毒以及4份临床疑似病料均发生特异性反应。     

抗Luman募集因子N端单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗Luman募集因子N端(Luman-recruiting factor N terminal,LRF-N)蛋白的单克隆抗体。【方法】PCR扩增LRF-N端的194bp序列,构建LRF-N重组质粒pGEX-LRF-N,转染BL21(DE3)菌,诱导表达并纯化GST-LRF-N融合蛋白,以其作为抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次,每次间隔10d,第4次加强免疫3d后采取小鼠脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞融合,用ELISA和Western blot进行阳性细胞株的筛选和鉴定,对获得的杂交瘤细胞的细胞核型、分泌稳定性以及所分泌的单克隆抗体进行鉴定。【结果】pGEX-LRF-N在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,GST-LRF-N蛋白分子质量约为33ku,与预期结果一致。试验共获得3株稳定分泌抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2AC9、2AG10和3G7。单抗2AC9、2AG10、3G7能够特异性地识别GST-LRF-N蛋白,亚型鉴定结果显示,其重链分别为IgG2a、IgM和IgG1。【结论】获得的抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株2AC9、2AG10、3G7单抗特异性良好,能够稳定分泌抗体,可用于小鼠LRF蛋白生物学功能及活性的进一步研究。     

产单核细胞李斯特菌溶血素O单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗产单核细胞李斯特菌溶血素O(LLO)的特异性单克隆抗体。【方法】用LLO重折叠的原核表达产物LLO-his免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞,与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,经间接ELISA法筛选、多克隆及单克隆分离出阳性细胞株后,再用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,间接ELISA法测定其效价及相对亲和常数;用HBT单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚型;常规方法制备染色体,观察细胞株染色体数目及标志染色体;Western blot检测抗体的特异性。【结果】获得了2株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为3F5-G3和2B4-C8,其腹水效价分别为1∶(1×105)和1∶(1×107);染色体分别为97±5和93±8条,且观察到标志染色体;相对亲和常数分别为0.49和0.26μg/mL;抗体亚类均为IgG1,轻链均为κ链。特异性鉴定结果表明,2种单克隆抗体均可与LLO蛋白发生特异性反应,而与载体蛋白不发生反应。【结论】获得了抗LLO的特异性单克隆抗体。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PCR扩增出915bp的目的基因,成功连接于pET-28a载体,并转化大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1∶103、1∶105、1∶103,亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV gB蛋白特异性结合,IFA结果表明4株单抗是针对DPV产生的。【结论】成功获得了特异性针对DPV gB蛋白的单克隆抗体。     

加拿大的农业科技及其组织管理

本文详细介绍了加拿大农业科技体制改革及其组织,其总的研究发展方向由加拿大政府掌握.把科技政策、研究发展方向和国家需要结合起来通盘考虑,自上而下提出科研项目.     

保护地蔬菜病虫害发生特点及其综合防治

根据保护地蔬菜病虫害发生特点,掌握综合防治方法,把病虫为害损失控制在经济允许水平之下,达到优质、高产、低成本和农产品无污染的目的。     

秦汉时期的中印交通与农业科技文化交流

对秦汉时期中国与印度的交流进行考证,在丰富的史料基础上,研究了当时中印的交通状况与农业科技文化交流。     

矿难与科学技术

煤矿事故时有发生．分析认为发生事故的本质原因是工作人员缺乏有关的科学技术知识．发展、掌握、运用科学技术。提高人员的科学技术素质。不仅能促进经济发展，而且能保障人身安全，战胜灾害(包括煤矿灾害)．     

网络文化与高校思想政治工作研究

近年来,在社会经济的不断推动之下,互联网技术得到了飞速发展,随之而来的则是网络文化的兴起,这对于高校思想政治工作带来了较大的冲击,但同时也是一种新的挑战;因而各高校要对网络文化树立正确的认知,将其与高校思想政治工作相互结合,因势利导,才能推动高校思想政治工作的不断深入。本文针对当前网络文化与高校的思想政治工作展开进一步的研究与分析。     

高校思想政治教育与创新创业教育的双向构建

高校顺应社会经济发展要求,越来越重视思想政治教育与创新创业教育的融合。分析了思想政治教育与创新创业教育的互动关系,阐述了思想政治教育与创新创业教育双向构建优势,提出了构建的对策:教育理念层面实现互相融合、教学内容层面实现丰富升华、实践活动层面实现有机结合和组织管理层面实现系统完备。     

雪松的栽植及后期管护

雪松是常绿的观赏树种,栽植时要选择恰当的栽植季节、苗木和采取正确的挖掘方法,后期管护浇水、施肥,加强高温季节以及越冬的管护。