禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。     

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒（PRV）的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。     

基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测

为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%.     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白体外稳定性研究

为筛选猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在体外的稳定性条件,采用建立的PCV2双抗夹心ELISA方法,对Cap蛋白在不同贮藏条件下的抗原活性进行了检测。结果表明,Cap蛋白在25℃以下贮存时,其活性保持稳定;贮存时温度变化对蛋白质稳定性影响较大;在甘氨酸和甘油2种蛋白保护剂存在条件下,蛋白质活性稳定性增强。表明,Cap蛋白的体外贮存、改造及病毒样颗粒组装应在25℃以下进行,尽量避免温度剧烈变化,同时添加蛋白质保护剂有利于蛋白质的体外稳定。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核可溶性表达及分析

为得到可溶性表达的Cap蛋白并确定其抗原活性及存在形式,通过对IPTG浓度、诱导表达温度和时间进行优化,最终确定在OD600值为0.6～1.0时加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导4h为最佳的诱导表达条件。镍离子亲和层析对Cap蛋白进行纯化后,间接ELISA表明,重组Cap具有良好的抗原活性。非还原SDS-PAGE电泳分析表明,Cap重组蛋白除以26ku的单体分子存在外,还有一部分形成52ku的二聚体,为Cap病毒样颗粒的制备奠定基础。     

氟苯尼考注射用混悬乳剂的制备及性质考察

采用多指标综合分析方法为评价指标,制备氟苯尼考缓释混悬乳剂,并对其理化性质及质量进行了考察。通过正交设计法筛选出最优处方和制备工艺,用高压均质乳化法制备O／W型氟苯尼考混悬乳剂。结果显示：氟苯尼考混悬乳剂最佳处方为注射用大豆油30％,乳化剂8％,油酸0．08％,制备温度70℃。最佳处方平均粒径为1．87μm,pH值为7．32,黏度为23．8mPa·s。影响因素试验表明,高温对混悬乳剂稳定性的影响比较大;（30±2）℃条件下考察6个月,平均粒径、pH值及含量等均无明显变化,理化性质稳定。表明所制备的氟苯尼考混悬乳剂符合药典规定的肌肉注射要求,筛选出的处方工艺经中试放大后制备的混悬乳剂性质稳定,可以进行工业化生产。     

猪圆环病毒2型主要蛋白编码序列的密码子偏性分析

为进一步了解猪圆环病毒2型(PCV2)分子进化特点,以PCV2主要蛋白编码序列ORF1和ORF2为研究对象,对74株不同亚型(2a-2e)PCV2进行核酸组成、相对同义密码子使用频率(RSCU)、有效密码子数目(ENC)、中性绘图和密码自适应指数等生物信息学分析,以了解PCV2密码子使用模式及其影响因素.结果显示,相比...     

2种剂型麻保沙星在健康家犬体内药物动力学比较

选用健康家犬6只,按随机交叉设计试验,单剂量给药均为每千克体重2.75 mg,用高效液相色谱法测定血药浓度,并应用3P97计算药物动力学参数。结果肌肉注射与口服麻保沙星的药时数据符合一级吸收一室开放模型,主要药物动力学参数如下:T1/2ka(吸收半衰期)分别为(0.52±0.41)h和(0.41±0.13)h,T1/2ke(消除半衰期)为(4.40±1.86)h和(6.25±1.80)h,Tpeak(峰时间)为(1.53±0.75)h和(1.68±0.39)h,Cmax(峰浓度)为(1.36±0.38)μg/mL和(0.93±0.06)μg/mL,AUC(药时曲线下面积)为(10.64±2.66)(μg.h)/mL和(8.68±1.98)(μg.h)/mL。乳酸麻保沙星在健康家犬口服与注射给药吸收迅速,表观分布容积大,消除缓慢,口服给药较肌肉注射吸收后分布的组织更深更广。