猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。     

禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。     

新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度。结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰。综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰。     

猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。     

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV）S1蛋白的CHO细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。