以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒（PRV）的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。     

旋毛虫南阳猪体分离株的生物学特性研究

观测了旋毛虫南阳猪体分离株的形态大小,测定了其在小鼠和猪体中的繁殖力指数、雌虫体外产新生幼虫的能力和对低温的耐受性。测得该虫株雄成虫、雌成虫和发育充分的肌幼虫的长宽度分别为(1.415±0.164)mm×(0.048±0.014)mm,(2.627±0.246)mm×(0.056±0.018)mm和(1.112±0.185)mm×(0.038±0.013)mm;其在昆明小白鼠和三元杂交猪体中的繁殖力指数分别为(112.0±59.65)和142.5;平均每条雌虫体外产新生幼虫(56.76±5.13)条;在猪肉中的感染性肌幼虫置-32℃36 h或-22℃60 h即全部死亡。结果表明,该旋毛虫南阳猪体分离株的上述生物学特性与猪旋毛虫(T.spiralis)的特性相似。     

鸡Igγ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igγ轻链基因中，并将鸡Igγ轻链信号肽与Pegfp—C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp—C1-SP。鸡Igγ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点，构建了带有信号肽的鸡Igγ轻链／GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后，荧光显微镜观察，重组鸡Igγ轻链／GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达，而载体pEGFP—C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明，牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其特性

以戊二醛法将盐酸克伦特罗 (Clenbuterol,CL)连接到牛血清白蛋白 (BSA)上制备抗原(BSA -CL) ,并以BSA -CL免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与NS0细胞融合 ,建立分泌CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞培养上清的检测、鉴定 ,筛选出 1 7株高亲和力的杂交瘤细胞株 ,其中C - 4C9、C - 2D6、C - 4G1和C - 2H6的培养上清ELISA效价为 1∶5 1 2 ,1∶640 ,1∶81 0和 1∶2 5 6;腹水ELISA效价为 5× 1 0 - 6,1 .7× 1 0 - 5,2×1 0 - 6和 3.3× 1 0 - 5。 4株单抗与 β -肾上腺素激动剂沙丁胺醇的交叉反应性为 0 .79% ,与肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素及畜禽常用抗生素无交叉反应性。可以作为制备CL快速检测的特异性单克隆抗体应用     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

磺胺间甲氧嘧啶全抗原的制备研究

采用重氮化法，将半抗原磺胺间甲氧嘧啶（SMM）与载体牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联，制得磺胺间甲氧嘧啶全抗原SMM—BSA和SMM—OVA。通过其紫外扫描光谱、SDS—PAGE凝胶电泳试验，表明半抗原和载体成功偶联，免疫动物以后可以产生满意效价。这另进一步制备抗SMM抗体提供了良好的免疫原。     

免疫学技术在霉菌毒素检测中的应用

中国是饲料生产第一大国,饲料质量安全关系到养殖业发展的兴衰。霉菌毒素污染严重危害饲料及饲料原料质量安全,因此,建立毒素检测方法对预防霉菌毒素污染,减少毒素中毒事件发生至关重要。综述了霉菌毒素的性质、危害及免疫学检测方法的发展,并展望了毒素检测方法的发展趋势。     

猪流行性腹泻病毒S2基因的克隆与遗传进化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)新流行毒株的遗传变异情况,本研究对2014—2018年间采集的205份PEDV疑似阳性样品进行RT-PCR检测、扩增PEDV S2基因并进行遗传转化分析。RT-PCR结果显示,205份疑似阳性样品中有191份扩增出单一条带,片段大小为1 887 bp,符合S2基因的扩增预期。试验样品阳性检出率为93. 17%。测序分析表明,试验共获得25株S2基因序列,与参考毒株之间核苷酸的同源性为94. 3%～99. 6%,氨基酸的同源性为86. 4%～96. 2%。遗传进化分析结果显示,试验得到的PEDV毒株分属于G1、G2亚群。本研究为PEDV防控以及疫苗毒株筛选奠定基础。     

植酸酶鼠源多克隆抗血清的制备

 【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50 μg蛋白/只?次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ng?mL-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59 、163.80和166.51 ng?mL-1,交叉反应率分别为89.85%、90.88%和89.41%。100℃煮沸5 min后的麸皮、市售普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩酶半数抑制浓度分别为2 871.34、5 208.85、7 914.12和5 804.24 ng?mL-1,交叉反应率分别为5.18%、2.86%、1.88%及2.56%。【结论】制备出了具有高效价、高灵敏度和特异性的鼠源植酸酶多克隆抗体,为植酸酶单克隆抗体制备及植酸酶ELISA检测试剂盒研制奠定了基础。