沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的定位

用淋巴细胞杂交瘤技术研制成４株沙门氏菌属特异单抗ＣＢ８，ｄｅ７，ｃｃ６，ＤＤ４，在免疫转印试验中，证实它们所识别的抗原表位位于鞭毛蛋白上，ＥＬＩＳＡ相加试验及竞争试验显示，ＣＢ８和ｃｃ６与ｄｅ７，ＤＤ４识别的抗原表位不同，表明鞭毛蛋白的属共同抗原具有多种表位的特性。     

沙门氏菌属鞭毛蛋白共同抗原表位的初步定位

沙门氏菌属鞭毛蛋白共同抗原表位的初步定位焦新安，杨静，王志亮等，（江苏农学院畜牧兽医系）／／中华微生物学和免疫学杂志，１９９３，１３（６）：３５１～３５３间接免疫荧光试验和免疫胶体金试验中，证实ＣＢ８，ｄｅ７，ｃｃ６，ＤＤ４识别的抗原表位重复出现于鞭...     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞杂交瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ１、４ＡＦ１、６ＤＨ８及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ８２株单抗特异性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩＳＡ测定，各株单抗４０ｈ培养上清效价达１０－２～１０－４，第７天腹水效价达１０－５～１０－６，４ＡＦ１、６ＤＨ８与所试７个ＩＢＶ标准株及２个ＩＢＶ分离株都发生反应     

兔出血症病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

通过ＥＬＩＳＡ迭加试验对５株抗兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的抗原表位进行了分析。抗体反应增值结果表明，６株单抗分别针对３类不同的抗原决定簇。ＣＧ４－１、ＣＨ３－１和ＡＡ８－１针对病毒结构多肽上的同一决定簇，ＣＦ２－１和ＲＭ－１７针对另一决定族，而ＲＭ－１４针对第３种决定簇；其识别表位可能与ＡＡ８－１非常接近。单抗的识别表位与其生物学活性密切相关。     

钩端螺旋体七日热血清型(56610)特异性单克隆抗体的研制

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤．抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类．     

钩端螺旋体七日热血清型（56610）特异性单克隆抗体的研制

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬ Ｂ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤。抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞发校瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ、４ＡＦ１、６ＤＨ及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ６２株单抗牧场卉性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩ     

法氏囊三肽囊素(Bursin)的研究 Ⅱ.Bursin在鸡体免疫器官中免疫组织化学的定位

以抗Ｂｕｒｓｉｎ单抗２Ｆ９－４，用免疫组织化学方法，检测Ｂｕｒｓｉｎ在鸡胚胎期及出壳后１～９周龄雏不同免疫器官中的定位分布。结果表明：胚胎期１２日龄囊（上皮芽、上皮）、骨髓呈阳性；１４日龄囊（上皮芽、芽突）、胸腺髓质有阳性细胞；２０日龄胸腺有阳性细胞。新生雏囊单层或假复层上皮ＦＡＥ和ＩＦＳＥ呈阳性、髓质有稀少ＤＲＥＣ阳性、ＣＭＥ弱阳性。出壳１～３周ＤＲＥＣ与哈德氏腺阳性，反应随周龄增加有所增强，胸腺髓质呈阳性，３周脾脏极少数散在阳性细胞。４周ＣＭＥ、ＤＲＥＣ、ＩＦＳＥ与ＴＤＩＡ的基底膜有阳性细胞。６周ＦＡＥ、ＦＡＥＳＣ、ＣＭＥ、ＤＲＥＣ、ＩＦＳＥ与ＴＤＩＡ的基底膜有阳性细胞。８周ＦＡＥ、ＦＡＥＳＣ、ＣＭＥ、ＤＲＥＣ呈阳性。９周ＣＭＥ、ＤＲＥＣ呈阳性。４，６，８，９周Ｈａｓａｌ小体、６，９周骨髓呈阳性；４，６周脾脏散在阳性细胞；４，６，９周哈德氏腺有阳性细胞。     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．单抗抗原结合位点分析表明４Ｄ１１和３Ｇ１２两单抗作用于同一抗原决定簇     

NDV单抗针对多肽抗原的鉴定

经对液氮保存的抗鸡新城病毒单抗杂交瘤细胞株进行复苏，再克隆，并用ＥＬＩＳＡ和ⅡＦ筛选，得到２４株分泌力较强的细胞株。将这些细胞株再接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取其胜利水进行预处理，测春ＥＬＩＳＡ效价、ＩＩＦ效价，并用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ测定它们所针对的中国标准强毒株Ｆ４８Ｅ８的多肽原表位。测得的结果均为针对血凝素－神经氨酸酶的单抗。     

用PCR和ELISA方法分析奶牛血清和奶中类乙型肝炎病毒

用人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）ＥＬＩＳＡ试剂盒检测８５份奶牛血清和９３份奶样。结果测出３３份血清为ＨＢｓＡｇ阳性，其中４价亦为ＨＢｅＡｇ阳性；２２份奶样为ＨＢｓＡｇ阳性，其中１１份亦为ＨＢｓＡｇ阳性。７个双阳性的样本，用针对ＨＢＶ表面抗原基因不同部位的两对引物作ＰＣＲ分析，结果未能扩增出特异片段，排除了奶牛ＨＢＶ血清学阳性是由人ＨＢＶ感染所致。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

羊附红细胞体抗原的分析及初步应用

将提取的羊附红细胞体抗原进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析,并以此抗原为诊断抗原,用ELISA方法对64份羊的血清样本进行了初步检测。结果表明,56kDa和26kDa的羊附红细胞体抗原具有较好的免疫性,而且不与羊附红细胞体阴性血清和羊支原体病阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;ELISA检测的64份血清样本的阳性率为66.7%,比涂片镜检高22.9个百分点。     

牛白血病免疫酶技术的研究

本文介绍用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测牛白血病病毒(BLV)的抗体。以FLK-BLV细胞培养液制备的免疫扩散(ID)用的粗提抗原,经ConA-Sepharose 4B亲和层析,或先经乙醚处理,再经Sephadex G-150层析等方法,分别提取了gp和p抗原。用gp抗原作ELISA,对91份牛血清样品进行检测,阳性共67份,比微量免疫扩散(MID)高14％,两者的符合率为85％。用p抗原作ELISA对240份牛血清样品进行检测,阳性占162份,比MID法高12％,两者的符合率为87％。用gP抗原对33份样品和用p抗原对160份样品进行三次重复试验,它们的变异系数在10％以内的分别为100％和92.5％。ELISA抑制试验表明,p抗原和gP抗原对BLV抗体的特异性良好。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

应用间接血球凝集(IHA)试验诊断猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)病

本文用猪囊尾蚴的全囊虫、囊液、头节的粗提抗原(CW_1,CF_1,CS_1),和其超速离心上清液抗原(CW_2,CF_2,CS_2)以及其经葡聚糖凝胶柱(Sephadex G—150)层析提纯的抗原(CW_3,CF_3,CS_3)分别对人工感染的猪囊尾蚴、细颈囊尾蚴猪和不感染的对照组猪,以间接血球凝集试验(IHA)进行定期的检测。结果表明,CW_2,CW_3,CF_2和 CS_2抗原的敏感性较高。进而用此4种抗原对自然感染的猪囊尾蚴猪进行了扩大诊断试验。试验结果:CF_2的敏感性高于其它抗原,但特异性较差,其检出率为76.87%,假阳性率为16.07%;而 CW_3抗原的敏感性虽较 CF_2抗原差,但特并性较强,检出率为64.88%,假阳性率为2.5%。两种抗原的重复性均良好。     

Development of a Synthetic Peptide ELISA Assay for the Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus Nonstructural Protein Antibodies

In order to develop an ELISA assay with synthetic peptides for the detection of antibody to the nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus, specific peptides were synthesized by a solid-phase method according to FMDV NSPs B-cell epitopes, and were conjugated to carrier protein BSA. An ELISA system was developed to detect FMDV NSPs antibody with the conjugated proteins as the coating antigen. The optimal coating concentration of the antigen was determined as 2.5 μg mL-1. The comparative study of this assay with UBI NSP ELISA kit and national commercial 3ABC ELISA kit in the detection of 199 serum samples showed that they were very coincident, and the identity rates were 96.48 and 97.48%, respectively. The development of ELISA using the synthetic peptides as coating antigen is specific, reproducible, stable, and easy, and can be used to differentiate FMDV infected pigs from immunized pigs.     

猪圆环病毒Ⅱ型血清抗体ELISA检测方法的建立

为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次重复试验,方差分析显示P0.05,差异不显著;与PCV2-ELISA试剂盒(INGEZIM公司生产)的符合率比较,其总符合率达88.89%.可见,优化建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性高、稳定性好,可用于PCV2血清学诊断和血清学普查.     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.