牛白血病病毒囊膜抗原的制备

用Eagle氏MEM营养液繁殖FLK—BLV细胞株,按照J.M.Miller和M.J.Van Der Maaten创造的方法生产牛白血病病毒的囊膜糖蛋白抗原(gp)。本抗原应用于免疫扩散试验,以检测白血病感染牛。用100份阳性和阴性血清样品与从美国引进的参考抗原作比较,试验结果完全一致。     

免疫扩散试验用于牛白血病病毒感染的血清流行病学调查

以免疫扩散(ID)和改良的微量免疫扩散(MID)试验,对宁沪地区13个乳牛场的1402头黑白花乳牛进行牛白血病病毒(BLV)感染的血清流行病学调查。结果在13个牛群中有3个为无BLV感染牛群;1个为低感染牛群,阳性率为2％;5个高感染牛群,阳性率为21.73％—61.70％。另2个群—血检隔离群和血检追踪群,其阳性率为89.79％和90.09％。所有高感染牛群均有白血病病史,但出血淋巴肉瘤的发病率差异很大。这主要与是否存在对BLV易感的遗传家系有关。ID阳性牛分布与年龄有密切关系。年龄愈大,阳性率愈高。18个月以下的未育成牛阳性率普遍较低。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的间接ELISA检测

为了建立快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)抗体的间接ELISA方法,将质粒pET-rApxⅡ转化至BL21,IPTG诱导表达毒素rApxⅡ融合蛋白,经亲和层析纯化后的蛋白作为检测抗原.对ELISA各检测条件进行优化,结果显示,抗原最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80.用建立的ELISA方法对猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪副嗜血杆菌、大肠杆菌阳性血清进行检测,均无交叉反应.利用建立的ELISA方法从172份临床血清样本中检测出84份阳性血清样本,而利用Cps-ELISA试剂盒检测到74份阳性样品,本方法检测总符合率达83％.     

酶联免疫吸附试验检测姜片虫感染者血清抗体

超声粉碎制备姜片吸虫成虫冷浸抗原,以1:3500工作浓度包被酶标板;采用Kato—Katz氏定透法普查姜片吸虫病,对虫卵阳性者用ELISA法测定血清抗体,同时测定健康居民的血清和其他吸虫病患者血清,以评价ELISA法检测姜片虫病血清抗体的敏感性、特异性和交叉反应性。按常规ELISA方法操作,目视与酶标仪判断结果。普查2 189人中姜片吸虫卵阳性者168例;168例中165例ELISA阳性,ELISA与Kato—Katz氏定透法的阳性符合率98.21％;健康居民血清147份,阳性6份,阳性率4.08％;与血吸虫病交叉阳性为9.38％,肺吸虫病交叉阳性为5.36％。应用此法检测姜片虫感染者血清抗体具有敏感性高、特异性强和交叉反应率低等特点,可代替粪检法广泛用于姜片吸虫感染的检测。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

间接ELISA 与中和试验检测O 型FMDV 疫苗免疫猪血清抗体的比较研究

血清中和抗体滴度的高低,体现了血清对病毒感染的中和能力,是评价疫苗免疫效果的重要指标.对国内3个大型猪场共120头猪的血清样品分别进行O型口蹄疫病毒ELISA和病毒中和试验,并分别比较两种方法的符合率和阳性检出率.结果表明,两种方法的阳性符合率和阴性符合率分别为77.3％和72.2％,总符合率为75％,均能有效检测猪血清中的口蹄疫抗体水平,但是采用间接ELISA检测血清抗体,存在一定比例的假阳性或假阴性.病毒中和试验更适合进行口蹄疫血清学的检测.     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立

选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法.结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min.对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%.     

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

 为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.（双侧）=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD 公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。     

猪乙型脑炎新型协同凝集试验与酶联免疫吸附试验(ELISA)方法的比较

用新型SPA(Staphylococcal Protein A)协同凝集试验对88份猪血清进行了乙型脑炎病毒(JEV)抗体检测,并与酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了对比,两种方法检测结果为:ELISA检测阳性率为62.5%(55/88),SPA阳性率为68.18%(60/88),二者阳性符合率为90.0%(54/60),总符合率为86.3%(76/88).对8份SPF猪血清进行检测,两种方法检测结果均为阴性.结果表明,SPA与ELISA检测乙型脑炎结果符合,前者更为简便和实用.     

木薯粉及制品中高灵敏度AFB1快速检测方法研究

【目的】基于酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测原理,建立高灵敏度的直接竞争法检测木薯粉及其制品中的黄曲霉毒素B₁（AFB₁）,为木薯食品安全提供技术支持。【方法】通过对AFB₁抗原结构改造、免疫和细胞融合等过程获得抗原抗体,建立高灵敏度检测方法,并进行木薯粉及其制品样本的实例验证。【结果】制备的AFB₁抗原和抗体,其抗体亚型均为IgG₁,灵敏度最高的3F2细胞株产生的抗体对黄曲霉毒素G₁、G₂和B₂交叉反应率分别为21.4%、1.9%和8.8%,且对其他毒素类无交叉反应,建立的ELISA线性区间为0.02~0.48 μg/kg,半数抑制浓度（IC₅₀）为0.047 μg/kg,标准方程为y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）。以35%甲醇水溶液作为标准品稀释液,木薯食品原料用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl作为提取液,含油脂的木薯糕点用70%甲醇水溶液作为提取液,所有样本均为10倍稀释,检测限0.2~4.8 μg/kg,样品添加回收率81.5%~120.0%,变异系数均小于8.5%。应用验证试验表明,自建ELISA试剂盒对96份样本检出19份阳性样本,购买试剂盒检出7份阳性,大于2.0 μg/kg的样本检测结果完全符合,自建ELISA试剂盒方法灵敏度优于购买的ELISA试剂盒。【结论】本研究建立的直接竞争ELISA方法灵敏度高,操作简单,可广泛应用于木薯粉及其制品样本中AFB1的快速测定。     

PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法的建立

用亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400 ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D_(490 nm)≥0．43D_(po■) 0．57D_(neg)判为阳性,反之判为阴性。对采自14个猪场的364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为51．4%,略高于HerdChek ELISA的阳性检出率49．7%。与HerdChek ELISA相比,间接ELISA的敏感性为94．5%,特异性为91．3%,总符合率为92．9%,Youden指数为0．86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性,并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。该方法的成功建立将为我国PRRS的防制工作作出贡献。     

口蹄疫抗体免疫层析试纸的临床应用及性能评价

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种ELISA方法的符合率分别为95.06%和96.55%。说明该试纸可以用于猪FMDV O型抗体的临床检测,为评价口蹄疫疫苗免疫效果提供了快速、简便的方法。     

草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。     

单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究

从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。     

仔猪血清猪瘟抗体动态的数学模型

作者对8窝104头仔猪血清的猪瘟抗体用酶联免疫吸附试验间接法进行测定,在获得大量数据的基础上,使用多项式回归分析方法,建立了仔猪血清猪瘟抗体酶联免疫吸附试验测定A值(y)关于日龄(x)的回归方程,本模型的意义在于对各日龄(3日龄～25日龄)仔猪血清猪瘟抗体A值的观察值能进行点预测及区间预测。另4窝45头仔猪血清猪瘟抗体A值作为考验样本,考验样本值都落在置信度:勾0.90的预测区间之内。模型提示,猪瘟抗体水平的最低点在20～21日龄;猪瘟母源抗体的半衰期为11.86天。     

磺胺嘧啶多克隆抗体的制备

为制备磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)多克隆抗体(pAb),用重氮化方法将SD偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成免疫抗原BSA-SD和包被抗原OVA-SD。用紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳试验检测,结果表明偶联成功。用BSA-SD免疫新西兰大白兔,间接ELISA测定多克隆抗体效价。阻断ELISA结果显示:SD单克隆抗体(pAb)的IC50达19.19ng/mL,和其他磺胺类药物交叉反应小于等于2.7%。结果表明,获得了高效价和特异的pAb。     

Development of a sandwich Dot-ELISA for detecting bovine viral diarrhea virus antigen with E2 recombinant protein

The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO₄. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL⁻¹, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and 45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL⁻¹. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were 90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily interpreted without an ELISA reader.