黄曲霉毒素B1高灵敏定性定量免疫层析检测方法的建立

  目的  真菌毒素可污染农产品和动物源性食品，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性强、危害大，建立AFB₁快速、高灵敏和便捷的检测方法对于监测相关产品中AFB₁污染水平，保障人和动物健康均具有重要意义。基于侧向层析技术原理，采用竞争模式，优化建立免疫层析检测方法，以实现AFB₁的快速定性检测和定量分析。  方法  通过比较分析不同粒径金颗粒标记抗体效果，优化确定免疫层析各组分材料类型、相关缓冲液配方及最佳使用质量浓度，建立AFB₁高灵敏定性定量免疫层析检测方法。  结果  优化建立的AFB₁免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg?1，灵敏度高、特异性强，与其他常见真菌毒素无交叉反应，加标回收实验结果显示:该方法准确稳定，且对AFB₁天然污染样本的定量检测结果与商品化试剂盒及LC-MS/MS一致性较好。  结论  本研究制备的免疫层析检测法可用于样本中AFB₁污染的快速定性检测与定量分析，适合缺乏实验条件的基层检验检疫机构和农产品加工企业对大量样本进行快速筛查，样本检测结果疑似阳性再采用仪器法进行确认，可降低检测成本，提升检测效率，同时为建立其他病原微生物免疫层析检测方法提供参考。图9表2参26     

AFB1降解菌的分离鉴定、降解条件优化及降解产物毒性评估

【目的】从土壤样品中筛选能降解黄曲霉毒素B（ 1 Aflatoxin B₁,AFB₁）的菌株,并研究其对AFB₁的降解性质及抑制黄曲霉菌能力,评估其作为微生物降解AFB₁制剂的潜力,为进一步开发AFB₁脱毒剂提供参考依据。【方法】以香豆素为唯一碳源,筛选出1株高效的AFB₁降解菌,通过16S rRNA基因测序得知菌株所属种属,并利用高效液相色谱确定菌株降解AFB₁的特性,通过单因素试验优化该菌株降解AFB₁的效率,共培养分析其对黄曲霉菌的抑制作用,最后利用SOS显色反应评估菌株对AFB₁的脱毒效果。【结果】通过液相色谱检测,获得1株菌株GDAAS003对AFB₁的降解率相对较高,其16s rRNA基因序列与链霉菌Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1）的相似性高达100%,菌株降解AFB₁的活性物质主要存在于上清液中,可能为胞外酶。GDAAS003上清液降解AFB₁的最佳pH为8.0的磷酸盐缓冲液,最适反应温度为30℃。经优化,菌株GDAAS003上清液对50 ng/mL AFB₁ 96 h的降解率可达90.50%,对100 ng/mL AFB₁ 96 h的降解率为75.68%。对降解产物的遗传毒性进行检测,结果表明菌株GDAAS003降解AFB₁的产物未表现出毒性,同时GDAAS003能抑制玉米中黄曲霉菌合成AFB₁。【结论】链霉菌GDAAS003既能以较高的降解效率降解AFB₁,又能抑制黄曲霉菌的生长,其在食品和饲料行业中有较大的商业应用前景。     

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD4500.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%~4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

农产品中黄曲霉毒素产毒菌标识性分子大容量反应体系 提高ELISA灵敏度

【目的】 为预防和降低黄曲霉毒素污染,在前期探明黄曲霉毒素产毒菌株鉴别标识性分子PO8蛋白的基础上,欲研究建立高灵敏、大容量反应体系的双抗夹心ELISA检测技术,为污染源头监控提供技术支撑。 【方法】 用干菌丝作标识性分子PO8蛋白的参考物,以高压均质制得的黄曲霉菌裂解液为检测抗原,纯化后的PO8-VHH作包被抗体,产毒菌株多抗作检测抗体,抗原、抗体分别以200 μL/孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验。优化相关理化因素,以阳性孔OD_450nm≥1.0,阳性孔OD_450nm/阴性孔OD_450nm较高为原则,确定最佳试验条件,建立标准曲线。并通过样品添加回收试验、重复性试验、特异性试验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。 【结果】 通过棋盘格试验确定了最佳包被抗体浓度为3.0 μg?mL ^-1,最佳多抗的工作浓度为2.5 μg?mL ^-1。优化反应条件确定：最佳抗体包被条件为4℃过夜,最佳封闭液为3%的BSA,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,最佳多抗作用条件为37℃反应50 min。在优化后的条件下建立了夹心ELISA方法的标准曲线,对黄曲霉菌检测限可达到0.1 μg?mL ^-1,比前期报道的常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍。该方法特异性强,与青霉菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、赭曲霉菌均无交叉反应,且检测非产毒黄曲霉菌株信号值较低,接近于阴性值。重复性试验显示,板间变异系数为1.5%—5.8%,板内变异系数为0.4%—3.2%,均小于7%,说明该方法稳定性好。采用该方法对花生、玉米等农产品进行添加回收试验,平均回收率在81.9%—109.0%。 【结论】 本研究建立的大容量反应体系夹心ELISA方法可快速、高灵敏地检测黄曲霉毒素产毒菌,为从源头上控制黄曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的检测技术支撑。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

长三角地区市场常见农产品中40种真菌毒素的污染状况和特征分析

【目的】分析长三角地区市场小麦、玉米、稻谷、番茄和桃等常见农产品中真菌毒素的污染水平和特征,为农产品安全监管提供科学依据。【方法】于2019年从长三角地区三省一市（江苏、浙江、安徽和上海）的超市、农家和农贸市场等抽样采集农产品720份,包括120份小麦、150份玉米、150份稻谷、150份番茄和150份桃。谷物样品先后经水和含1%（V/V）甲酸的乙腈溶液提取,果蔬样品经含1%（V/V）甲酸的乙腈溶液提取。提取液通过氯化钠和无水硫酸镁盐析后,采用超高效液相色谱串联质谱法准确测定其中40种重要真菌毒素的含量。分别采用卡方检验和单因素方差分析对农产品中真菌毒素的检出率和含量进行比较,采用Spearman相关对农产品中真菌毒素的含量与产地温、湿度的相关性进行分析。【结果】720份农产品中共检测到36种真菌毒素,主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、链格孢霉毒素、伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其修饰物和玉米赤霉烯酮（ZEN）等,总检出率为75.3%。其中,伏马毒素B₁（FB₁）检出率最高（49.0%）,其次为细交链孢菌酮酸（TeA）（37.5%）、伏马毒素B₂（FB₂）（35.7%）、腾毒素（Ten）（29.6%）、伏马毒素B₃（FB₃）（29.3%）、ZEN（22.6%）、DON（21.4%）、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）（10.7%）、赭曲霉毒素A（OTA）（10.4%）,赭曲霉毒素B（OTB）（8.1%）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G）（7.2%）、赭曲霉毒素C（OTC）（6.4%）、黄曲霉毒素B₂（AFB₂）（5.8%）和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）（5.4%）。59.5%的农产品样品受到2种或2种以上真菌毒素污染,同一份样本中被检出毒素数量最多达到23种。根据GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》,有1份玉米样本黄曲霉毒素B₁（AFB₁）超标,1份稻谷样本OTA超标,6份小麦和2份玉米样本ZEN超标,总超标率为1.4%,整体污染水平不高。农产品中真菌毒素的污染水平表现出一定的类型和地区差异。小麦中,Ten、TeA和DON污染最严重;玉米中,伏马毒素污染较普遍;稻谷中则主要为Ten、TeA和伏马毒素;果蔬中伏马毒素、赭曲霉毒素和链格孢毒素等真菌毒素检出较多。从地区来看,浙江省小麦样品中DON和ZEN污染水平最严重,安徽省玉米样品FB₁污染浓度较高,而江苏省稻谷样品中DON和ZEN的检出率和浓度水平均显著高于其他地区。相关性分析表明,谷物中Ten、TeA、FB₁、DON和ZEN等毒素的含量与产地温、湿度存在一定的相关性,而果蔬中毒素的含量与温、湿度均无相关性。【结论】长三角地区市场农产品被多种真菌毒素污染,总体污染水平相对较低,但单一样品受到多种毒素混合污染的情况较多,应引起一定的重视。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒#br#

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP 抗体的 ELISA 方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA 试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg•mL-1; 检测199 份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

四环素类药物多残留酶联免疫检测方法

 【目的】构建一种四环素类药物多残留酶联免疫检测试剂盒。【方法】将四环素类药物与载体蛋白相连作为抗原免疫动物,获得了抗四环素类药物的抗体,建立了动物性食品中四环素类药物残留的ELISA检测方法,并将该试剂盒的检测性能与进口试剂盒比较,对实际样品的测定结果与高效液相-串联质谱法比较。【结果】人工抗原中四环素与蛋白质分子的结合比约为15﹕1,血清效价达到1﹕2 000倍以上,50%抑制浓度(IC50)为3 μg?L-1左右,7种四环素类药物交叉反应率在58%～100%之间,牛奶和鸡肉中四环素类药物的检测限分别为6.6 μg?L-1和6.5 μg?kg-1, 在鸡肉中四环素、土霉素和金霉素的回收率在40%～120%之间。【结论】试剂盒的最低检测限为0.3 μg?L-1,检测范围为0.3～30 μg?L-1,可同时测定兽医常用的四环素、金霉素、土霉素和多西环素4种药物残留。灵敏度、精密度和准确度均能满足兽药残留检测要求。     

HPLC和UV法对比测定蚊不叮霜中VB1的含量

【目的】 对比研究高效液相色谱法(HPLC)和紫外可见分光光度法(UV)测定蚊不叮霜中维生素B₁含量。为高效、快速、准确测定蚊不叮霜中维生素B₁的含量奠定基础。【方法】 UV法的检测波长为246 nm,采用百分吸收系数法计算维生素B₁的含量;HPLC法检测波长为267 nm,色谱柱选用C18柱。【结果】 UV法在7.47～14.94 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 3),精密度实验RSD=0.30%,重复性实验RSD=1.04%,平均回收率105.13%,RSD=1.72%,样品在处理后30 min内稳定(RSD=0.91%);HPLC法在4.85～11.31 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9999),精密度实验RSD=0.28%,重复性实验RSD=0.90%,平均回收率101.77%,RSD=1.93%,样品在处理后12 h内稳定(RSD=0.39%)。【结论】 HPLC法测得三批样品的平均含量分别为8.39、8.39、8.45 mg/g;UV法测得三批样品的平均含量分别为8.73、8.70、8.77 mg/g。UV法及HPLC法的精密度、重复性均较好,但UV法测得含量及回收率均偏高,测定准确度不如HPLC法,且UV法稳定性较差,故最终确定采用HPLC法测定蚊不叮霜中维生素B₁的含量。     

吡咯伯克霍尔德菌WY6-5产二甲基二硫对储藏期花生黄曲霉及毒素的抑制作用

【目的】验证吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5的抑菌作用,评价其对储藏期花生黄曲霉（Aspergillus flavus）及毒素的防治效果,分析抑菌作用机制,鉴定活性物质,并检测其最低抑菌浓度,为储藏期真菌病害及毒素的防控提供新材料。【方法】采用非接触培养皿对扣培养法,检测菌株WY6-5对黄曲霉的抑制效果,添加活性炭,验证挥发性物质的抑菌作用;密闭储藏环境,检测WY6-5产二甲基二硫对花生黄曲霉及毒素的抑制效果;收集处理后的花生籽粒,锇酸固定,并进行扫描电镜观察,检测黄曲霉细胞显微结构变化,通过透射电镜观察,检测黄曲霉细胞内部结构的显微差异;购买活性物质标准品,梯度稀释,与黄曲霉菌丝和孢子对扣培养,分析最低抑菌浓度。【结果】吡咯伯克霍尔德菌WY6-5分离自茶园根际土壤,可产生挥发性物质二甲基二硫,并高效抑制黄曲霉的生长,抑菌率达95%以上;同时,在高水活度（a_w）条件下,WY6-5还可抑制储藏期花生黄曲霉和毒素污染;两种水活度下,对照组中发病率高达100%,黄曲霉毒素总含量分别为399.32 μg?kg ^-1（a_w 0.859）和3 143.19 μg?kg ^-1（a_w 0.923）;WY6-5添加组,花生黄曲霉发病率降为2%（a_w 0.859）与21%（a_w 0.923）,毒素含量降为4.86 μg?kg ^-1（a_w 0.859）和121.37 μg?kg ^-1（a_w 0.923）,与对照组相比,对毒素的抑制率达98.78%和96.14%。扫描电镜观察显示,WY6-5产生的挥发性气体能抑制黄曲霉孢子的萌发,透射电镜显示,黄曲霉细胞结构未呈现明显损伤。挥发性物质二甲基二硫抑菌作用明显,对黄曲霉菌丝生长的最低抑菌浓度为100 μL?L ^-1(物质体积/培养体积),对孢子萌发的最低抑菌浓度为50 μL?L ^-1(物质体积/培养体积)。【结论】吡咯伯克霍尔德菌WY6-5可产生高效抑菌挥发物二甲基二硫,在低浓度下即可完全抑制黄曲霉菌丝生长和孢子萌发,并能抑制储藏期花生黄曲霉的侵染和黄曲霉毒素的产生,为储藏期真菌病害及毒素的防控提供了新型生物材料。     

施钾和叶面喷施赤霉素对春小麦种子萌发的影响

【目的】研究施钾和叶面喷施赤霉素对春小麦种子胚根性状、发根力、芽长、干物质转运与消耗等的影响,为研究栽培措施对小麦种子萌发的影响规律提供理论依据。【方法】以新春31号小麦为供试材料,采用裂区试验设计,主区施钾量(K)设K₀(0 kg/hm²)、K₁₈₀(180 kg/hm²)和K₃₆₀(360 kg/hm²)3个水平;裂区叶面喷施赤霉素量(G)设G₁(0 g/hm²)、G₂(8 g/hm²)、G₃(16 g/hm²)、G₄(24 g/hm²)和G₅(32 g/hm²)5个水平。【结果】施钾量对不同萌发时间的总根长、根系体积、根系平均直径、发根力、芽长及籽粒干物质转运率有显著影响。随着施钾量增加,总根长、根系体积、发根力和芽长均表现为下降趋势,而根系平均直径则反之;籽粒干物质转运率随着施钾量增加表现为先升高后下降的趋势;其中,K₁₈₀水平比K₀和K₃₆₀水平显著高26.51％和38.15％。叶面喷施赤霉素对不同萌发时间的根系表面积、发根力和芽长影响显著。增加赤霉素用量,根系表面积下降,而发根力和芽长均表现为先增加后下降的趋势,且分别于G₃和G₂水平下达到最大,比G₀水平分别高25.89％和6.05％。随着萌发时间的推进,根系总根长呈线性增加趋势;根系表面积呈先增加,至第4 d后趋于平稳的变化趋势;而根系体积和根系平均直径均呈先增加后降低的变化趋势,且均于第4 d时达到最大。籽粒干物质转运率(Y₁)和消耗率(Y₂)的变化符合二次方程,分别为:Y₁ = 0.579 7 X² + 3.682 X + 0.246 6,Y₂ = 0.021 5 X² + 5.082 3 X + 4.064 6。【结论】施钾和叶面喷施赤霉素对小麦种子萌发有显著性影响,施钾量为180 kg/hm²、叶面喷施赤霉素为16 g/hm²时,有利于小麦萌发和幼苗壮苗。     

全麦粉和小麦粉中烷基间苯二酚同系物组成的对比分析

【目的】 建立全麦粉标记物烷基间苯二酚（ARs）的高效液相检测方法,对全麦粉和小麦粉中ARs同系物组成进行分析,实现全麦粉真伪品质评价。【方法】 探究高效液相条件,建立ARs同系物5-十七烷基间苯二酚（C17:0）、5-十九烷基间苯二酚（C19:0）、5-二十一烷基间苯二酚（C21:0）、5-二十三烷基间苯二酚（C23:0）和5-二十五烷基间苯二酚（C25:0）的高效液相检测方法,并进行方法学评价。以国内外全麦粉、小麦粉及小麦麸皮等共47份样品为研究对象,测定ARs同系物的含量,分析其ARs同系物组成,并进行热图分析和主成分分析。【结果】 选用ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm,5 μm,Agilent）色谱柱,流动相选用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液进行梯度洗脱,在紫外检测波长280 nm、柱温35℃、流速0.5 mL·min^-1、进样量20 μL条件下,可在35 min内有效分离5种ARs同系物,各个同系物的色谱峰峰形对称,分离度好。经方法学评价,该方法具有良好的精密度和灵敏度,标准曲线线性相关系数均大于0.999,检出限为0.06—0.19 μg·mL ^-1,回收率为81.16%—112.92%,精密度标准偏差为0.02%—4.02%,可作为ARs同系物的测定方法。通过热图聚类分析可知不同检测样品中ARs同系物组成及总量存在显著差异（P<0.05）。麦粉样品ARs同系物组成中C21:0最多,占33%—61%;C19:0次之,占12%—44%;C17:0、C23:0和C25:0的含量占比较小。美国、加拿大全麦粉的ARs同系物组成丰富度和含量相近,国外全麦粉中ARs同系物组成含量高于国内全麦粉。国内全麦粉中的ARs同系物组成比小麦粉中的ARs同系物组成丰富度高,但个别小麦粉除外。小麦麸皮F₁中ARs同系物组成和总含量显著高于全麦粉和小麦粉,其ARs总含量高达1 795.78 μg·g^-1,与其他样品相比差异显著（P<0.05）。经主成分分析得出,麦粉样品间的主要差异指标为ARs同系物组成含量,作为第1主成分,其累积贡献率为98.40%。小麦麸皮与其他麦粉样品的相对分散最远,中国小麦粉的分散度最大。美国全麦粉和加拿大全麦粉几乎重叠,而中国全麦粉和部分小麦粉与美国、加拿大全麦粉部分交叉。【结论】 本研究建立的液相方法能够有效、快速的对全麦粉中ARs同系物进行定量,适用于麦类全谷物产品中ARs同系物含量的测定。同时,通过全麦粉和小麦粉中ARs同系物组成对比分析可知,全麦粉中的ARs同系物组成丰富度优于小麦粉中的ARs同系物组成丰富度。     

播期和密度对滴灌冬小麦光合特性及产量的影响

【目的】研究播期和密度对新疆南疆滴灌冬小麦光合特性及产量构成的影响,分析适宜的播期及种植密度,为生产实践提供依据。【方法】以新冬22号(少穗型)和邯郸5316(多穗型)为材料,采用裂区田间试验设计,主区为3个播期:9月23日(B₁)、10月4日(B₂)和10月15日(B₃);副区为4个播种量:播种量3.15×10⁶ 粒/hm²(M₁)、5.1×10⁶ 粒/hm²(M₂)、7.05×10⁶ 粒/hm²(M₃)和9×10⁶ 粒/hm²(M₄)。【结果】滴灌冬小麦旗叶Pn和Tr在扬花期最大,新冬22号在B₂播期、邯郸5316在M₃播期下平均Pn最高。B₂M₂处理的Pn最高,新冬22号和邯郸5316分别达15.45和16.94 μmol CO₂/(m²·s);Tr以M₂处理最大M₄处理最小,随播期延迟,Tr呈缓慢上升趋势,并以B₂M₂(新冬22号)或B₂M₁(邯郸5316)最高,分别为6.35和6.08 μmol CO₂/(m²·s);旗叶SPAD以扬花期达最高,平均SPAD随密度增大或播期延迟而减少,B₁M₁处理最大,其次为B₃M₁(新冬22号)和B₂M₁(邯郸5316)。【结论】建立了播期、播量与产量的关系模型,提出了高产条件下群、个体发育指标。新冬22号在10月1日播种、播量315.30 kg/hm²,邯郸5316在10月2日播种、播量262.47 kg/hm²时产量最高,分别达8 271.88和9 116.19 kg/hm²;提出了晚播增密的技术参数。     

高效液相色谱-荧光检测法检测烤肉制品中5种硝基多环芳烃

【目的】明确烤肉制品中硝基多环芳烃（NPAHs）的含量水平,建立固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测器测定烤肉制品中5种NPAHs（1-硝基萘、2-硝基芴、3-硝基荧蒽、1-硝基芘和6-硝基苯并[a]芘）的方法。【方法】称取1 g真空冷冻干燥的烤肉样品,加入二氯甲烷超声提取并过滤收集滤液,重复提取3次。将滤液氮吹至近干,加入3 mL正己烷溶解。依次用二氯甲烷和正己烷活化多环芳烃固相萃取柱,上样后用正己烷荡洗样品管然后继续上柱;用正己烷淋洗,二氯甲烷洗脱;将洗脱液氮吹至近干,用乙腈溶解得到NPAHs待测液。向待测液中加入酸化甲醇和铁粉,磁力搅拌水浴加热40 min,离心并过滤膜后通过高效液相色谱-荧光检测器检测,其中色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse PAH柱,设置柱温40℃,进样量20 μL,流动相选用水和乙腈,采用梯度洗脱模式。【结果】5种NPAHs在相应质量浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.9940,检出限为0.12—2.17 μg·kg^-1,定量限为0.38—7.23 μg·kg^-1,平均回收率为53.16%—129.64%,精密度为1.91%—30.73%。利用该方法对我国5类典型的烤肉样品进行检测,测得5种NPAHs总含量为50.19—82.36 μg·kg^-1,其中6-硝基苯并[a]芘含量最高,约为31.01—35.89 μg·kg^-1,其次是3-硝基荧蒽,约为9.99—23.06 μg·kg^-1。【结论】固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测法适用于烤肉制品中NPAHs的分析;我国烤肉制品中普遍存在NPAHs。     

小麦籽粒黄色素含量检测方法的改良与应用

【目的】小麦籽粒黄色素含量是影响面制品颜色和营养品质的重要因素,为快速、准确、简便地检测小麦籽粒黄色素含量,对传统小麦籽粒黄色素测定方法AACC 14-50进行改良,为面制品颜色性状和营养品质遗传改良提供技术支撑。【方法】将酶标仪应用于小麦籽粒黄色素含量测定,对传统AACC 14-50法进行改良,分析改良方法的准确性和稳定性,探讨不同提取时间和保存时间对面粉黄色素含量的影响,利用新改良方法测定283份国内外小麦品种籽粒黄色素含量,进一步验证改良方法的有效性,发掘面制品颜色性状和营养品质优异的种质资源。【结果】改良方法与传统AACC 14-50法所测黄色素含量呈极显著正相关,相关系数达0.994（P<0.001）,方差分析显示,2种方法所测黄色素含量在品种间差异均极显著（P<0.01）。应用改良方法对144份小麦品种籽粒黄色素含量进行重复测定,3次重复两两间的相关系数分别为0.997、0.998和0.998。藁优5218、冀师02-2和郑麦366面粉黄色素含量在提取时间为30 min时达到最大值,分别为0.93、1.24和1.53 μg·g^-1,且提取时间为30—120 min时,黄色素含量保持在稳定水平（0.94—0.97、1.30—1.33和1.59—1.62 μg·g^-1）。在室温保存0—20 d的藁优5218、冀师02-2和郑麦366的面粉,其黄色素含量没有显著变化（0.93—0.97、1.29—1.33和1.60—1.64 μg·g^-1;P>0.05）。283份国内外小麦品种籽粒黄色素含量变异范围广,不同环境间相关系数为0.73—0.98。其中,黄淮麦区小麦品种黄色素含量平均值为1.15 μg·g^-1,变异范围为0.51—2.42 μg·g^-1;北部冬麦区平均值为1.57 μg·g^-1,变异范围为0.90—2.52 μg·g^-1;长江中下游麦区平均值为1.07 μg·g^-1,变异范围为0.56—2.54 μg·g^-1;国外品种平均值为1.61 μg·g^-1,变异范围为0.94—2.48 μg·g^-1。筛选到24份黄色素含量较低和26份黄色素含量较高的品种,可作为亲本材料用于面制品颜色性状和营养品质遗传改良。与传统方法相比,改良方法显著降低了工作量,缩短检测时间,效率提高12—15倍,且样本、试剂用量仅为原来的1/16,大大节约了成本。【结论】建立了一个准确稳定、经济高效、操作简便的小麦籽粒黄色素含量检测方法,可代替传统AACC 14-50法用于大规模样本黄色素含量测定。     

牛筋草EPSPS酶联免疫试剂盒的研发及应用

【目的】克隆牛筋草（Eleusine indica）中草甘膦的靶标基因EPSPS，获得牛筋草EPSPS重组蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体，组装酶联免疫试剂盒，检测牛筋草植株不同组织EPSPS的表达水平及蛋白含量，为快速鉴定抗性牛筋草提供简便工具。【方法】利用PCR方法克隆EPSPS基因全长；构建pET30a-EPSPS阳性质粒并转化宿主菌BL21，经IPTG诱导表达后获得重组蛋白；利用该重组蛋白免疫小鼠与新西兰大白兔，制备单克隆及多克隆抗体，并利用Western blot检测特异性；利用间接ELISA方法进行免疫配对试验，筛选出最佳配对抗体，优选各试剂工作浓度并组装试剂盒；用研制的试剂盒对不同种群牛筋草进行EPSPS含量检测，并与qPCR结果分析比较。【结果】牛筋草EPSPS的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸，编码540个氨基酸，理论等电点为8.80，该蛋白无跨膜区域。进化树分析结果表明牛筋草EPSPS与水稻EPSPS进化关系最近。诱导蛋白表达的培养条件为1 mmol·L^-1的IPTG，25℃，获得了纯度大于90%，浓度为3 mg·mL^-1的重组蛋白12 mg；编号为R1711和R1712的家兔免疫后产生的多克隆抗体有较高的效价，编号为M171070、M171071、M171072的小鼠产生的单克隆抗体效价较高。进一步筛选出单抗FL-374-08能与多克隆抗体组成最佳配对抗体；酶联免疫试剂盒包被抗体的最优质量工作浓度为2 μg·mL^-1，酶标抗体的最优工作浓度为10 μg·mL^-1；试剂盒线性检测范围为5—80 μg·kg^-1，检出限为5 μg·kg^-1。抗性牛筋草植株叶片中EPSPS的表达量是敏感植株的52.9倍，而茎中EPSPS的表达量是敏感植株的63.0倍。在抗性牛筋草叶片中EPSPS相对拷贝数是敏感植株的53.5倍，而茎中EPSPS的相对拷贝数是敏感植株的78.6倍。Western blot结果表明单抗与牛筋草EPSPS有特异性免疫，并能准确区分不同敏感性植株及不同组织的蛋白含量差异。酶联免疫检测结果发现抗性牛筋草茎中的EPSPS浓度可以达到6.0 μg·L^-1，而敏感植株叶片和茎中EPSPS蛋白的浓度分别为0.22和0.43 μg·L^-1。【结论】获得的牛筋草EPSPS单克隆抗体特异性强、灵敏度高，研发的EPSPS酶联免疫试剂盒能够快速、准确检测牛筋草EPSPS蛋白含量并鉴定牛筋草由EPSPS过量表达导致的草甘膦抗药性。