江苏省畜禽养殖场水环境中四环类抗生素污染研究

2009年在江苏省范围内采集27个规模化养殖场排水口和周围环境水体样品53个,用高效液相色谱-三重四极杆质谱对其中的土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TC)和强力霉素(DOX)等四环素类抗生素污染进行了检测.结果显示,土霉素、金霉素、四环素和强力霉素在水体样品中的检出率分别为60.4%、60.4%、34.0%和17.0%,污染量分别在0.07～72.91、0.10-10.34、0.08-3.67 μg·L-1和0.11～39.54μg·L-1之间,检出率以土霉素和四环素最高;猪养殖场中土霉素、四环素和强力霉素的污染量比牛和鸡场的要高,牛场中金霉素和强力霉素的污染量明显低于鸡场;从区域上看,苏南地区受到的污染明显高于苏北.     

己烯雌酚特异性抗体的制备

【目的】制备抗己烯雌酚（DES）的高亲和力特异性抗体,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,为进一步研究DES快速检测试剂盒打下基础。【方法】应用DES人工免疫抗原免疫新西兰大白兔,采集抗DES的特异性抗血清,用KCjunior软件进行4参数非线性回归,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,各药物浓度在同一批次酶标板中做4次重复,共做4个批次对标准曲线进行评价,用己烷雌酚（HEX）、双烯雌酚（DIEN）、雌二醇（E2）、乙炔雌二醇（EE2）和L-酪氨酸（Tyr）来评价抗体的特异性。【结果】5只家兔免疫产生了抗DES的特异性抗血清,其中4号家兔抗血清效价达到了1﹕4 096 000竞争抑制效果最好,工作稀释浓度为1﹕1 024 000时,线性范围在0.01～50 μg•L-1,标准曲线的IC50在0.71～1.0 μg•L-1,R2在0.9952～0.9978。获得各标准浓度下B/B0的批内变异系数在0.52%～22.48%,批间变异系数在2.64%～19.51%。交叉反应试验表明,4号家兔抗血清对与DES结构相似的人工合成二苯乙烯类雌激素药物己烷雌酚（HEX）和双烯雌酚（DIEN）的交叉反应率分别为8.5%和38.5%,与天然雌激素类药物雌二醇（E2）和乙炔雌二醇（EE2）以及L-酪氨酸（Tyr）的交叉反应均小于0.001%。【结论】本文报道的抗体特异性好、亲和力高,可满足目前中国动物性食品安全评价检测的需要,为研究组织中DES残留检测的ELISA方法及其开发DES快速检测试剂盒奠定了基础。     

鸡肉中氟苯尼考ELISA检测方法的建立及应用

 【目的】制备抗氟苯尼考（FFC）的高亲和力特异性抗体,建立检测氟苯尼考的间接竞争ELISA新方法。【方法】氟苯尼考分别与牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）经混合酸酐法偶联,得到免疫抗原和包被抗原,其偶联比分别为14.4和14.7。用免疫原FFC-HS-BSA免疫新西兰大白兔获得了效价较高的特异性抗体。建立并优化了间接竞争ELISA检测方法。【结果】抗血清效价为1﹕102 400。最佳包被抗原浓度为0.5 μg?ml-1,最佳抗体工作浓度为1﹕6 400,酶标二抗的工作浓度为1﹕20 000。回归方程Y = -0.1516X + 0.788（R2 = 0.9859）,检测范围为0.18～500 ng?ml-1,检出限为0.18 ng?ml-1,批内和批间平均变异系数分别为4.86%和7.77%。交叉反应试验中,抗血清与FFC结构相似的氯霉素和甲砜霉素交叉反应率分别为0.094%和0.098%,与其它药物交叉反应率均小于0.01%,表明该方法具有很强的特异性。FFC以浓度0.18～500 ng?g-1在鸡肉中添加,回收率为84.14%～106.1%,变异系数为2.1%～5.6%。【结论】成功获得了高效价、高特异性的抗FFC抗体,建立了鸡肉中氟苯尼考残留检测的ELISA方法。结果表明,所建立的检测方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点。     

超高效液相色谱法快速测定水产品中药物残留

建立利用超高效液相色谱仪二极管阵列检测器快速检测水产品中金霉素、土霉素、四环素的残留量的方法.样品通过四环素类快速检测前处理试剂盒中提取剂提取,固相萃取法进行净化,反向色谱柱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量.金霉素、土霉素、四环素浓度0.05～1.00 μg· mL-时呈线性关系,相关系数分别为0.999 9,0.999 5和0.998 8,金霉素回收率为69.0％ ～ 80.96％,相对标准偏差为0.7％～4.1％;土霉素回收率为80.00％ ～ 93.40％,相对标准偏差为0.4％～9.5％;四环素回收率为82.08％～97.60％,相对标准偏差为0.51％ ～9.98％.     

水产品中土霉素、四环素、金霉素残留同步测定新方法的建立

建立了梯度洗脱-高效液相色谱法同时测定水产品中土霉素、四环素、金霉素残留的方法,结果表明:样品经乙腈/高氯酸溶液超声提取,Waters C18柱净化,浓缩后经乙腈/柠檬酸溶液梯度洗脱,用紫外检测器在355 nm波长处检测,3种物质的分离效果较好,土霉素、四环素的检测限均为0.02μg/mL,金霉素的检出限为0.04μg/mL,3种抗生素的回收率在67.8%～90.1%之间,变异系数在2.34~7.86之间,较适用于水产品中四环素类抗生素残留的同时检测。     

测定猪肉中土霉素及金霉素残留的HPLC法建立

文章建立了测定猪肉组织中土霉素及金霉素残留量的HPLC法.该方法按照国家检测标准采用了5％高氯酸50 mL为样品提取液;乙腈+0.01 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(用30％硝酸调节pH2.5)=35:65为流动相;检测波长为355nm,进行测定.在此色谱条件下,土霉素、金霉素标准品浓度在0.1～1.0 μg· mL-...     

高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量前处理方法的优化

【目的】建立一种用高效液相色谱法快速检测鸡肉组织中5种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星)残留量的方法.【方法】样品的提取液由乙腈与三氯乙酸溶液(质量分数2%)按体积比1∶3的比例混合而成,流动相为乙腈-磷酸/三乙胺溶液(0.02 mol·L-1),荧光激发波长280 nm,发射波长450 nm.【结果和结论】添加低、中、高浓度水平时,回收率为84.71%~99.66%,变异系数为0.20%~4.34%.该方法检测诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为10μg·kg-1,达氟沙星的残留定量限为2μg·kg-1,沙拉沙星的残留定量限为20μg·kg-1.此法操作简单、实用,灵敏度高,可以满足鸡肉食品中氟喹诺酮类药物残留检测的需要.     

羊肉中8种有机磷农药残留的测定及基质效应

 【目的】建立气相色谱法同时测定羊肉组织中敌百虫等8种有机磷农药残留量,并对检测中的基质效应现象进行研究。【方法】样品用乙腈提取,N-丙基乙二胺作固相分散净化剂,火焰光度检测,基质匹配标准溶液内标法进行校准。【结果】羊肉组织中敌敌畏、乐果和马拉硫磷基质效应明显,其它几种有机磷农药基质效应较弱。建立的方法在2.5～300 μg?kg-1,线性良好,在50、100和200 μg?kg-1添加水平上,8种有机磷农药回收率为70.0%～103%,变异系数＜20%,检测限为0.5～1.9 μg?kg-1。【结论】建立的方法前处理简单、灵敏、准确、可靠,可以作为羊肉等动物性食品中有机磷农药残留量的检测。     

洱海流域畜禽饲料·粪便·土壤中四环素类抗生素残留分析

[目的]研究洱海流域畜禽粪便、饲料和土壤中的四环素类抗生素残留状况。[方法]以云南省洱海流域养殖业链为研究对象,采样分析了11个饲料样品、10个粪便样品、21个土壤样品中土霉素、四环素、金霉素残留状况。[结果]饲料中四环素、土霉素、金霉素的检出率分别为100%、100%、50%,其中猪饲料中土霉素、金霉素含量最高,其次是鸡饲料,奶牛饲料添加的抗生素相对较低;粪样中土霉素检出率为100%,四环素检出率为80%,金霉素检出率为90%,其中鸡粪中残留的抗生素最高;土壤抗生素残留较低,金霉素的检出率为66.6%,四环素、土霉素均未检出。[结论]洱海流域养殖业残留抗生素对环境和人体健康的风险较低。     

黄萎病菌毒素粗提液对棉花抗性酶的诱导

 【目的】对黄萎病菌毒素滤液诱导棉花体内抗病性相关酶的研究,探索棉花黄萎病菌诱导抗性的生理机制。【方法】以4种浓度[病菌滤液原液（VD）、1﹕20、1﹕40、1﹕50]的黄萎病菌毒素液,在0、12、24、48、60、72 h预处理后,观察4～6叶龄棉苗叶和根的外部表现及发病情况,测定其植株形态的4～6片真叶萎蔫指标和体内相关抗性酶的变化。【结果】（1）不同浓度的毒素液浸泡棉根48 h后,1﹕20组,真叶萎蔫,子叶倒挂;1﹕40组,真叶轻度萎蔫,子叶萎蔫;1﹕50组,仅表现为子叶失水,1～2片真叶略显失水,大多数真叶完好;而VD对照组表现为3级危害,严重萎蔫。当毒素液浓度降至1﹕50时,预处理棉苗72 h,虽子叶下垂,但真叶完好,对照全株萎蔫;再接高浓度毒素液48 h后,子叶倒挂,真叶开始失水,但对照子叶脱落,真叶严重失水且萎蔫。总之,1﹕50组对黄萎病的抵抗力均强于1﹕20与1﹕40组的预处理。（2）1﹕50预处理组不仅能降低棉株体内有害物质MDA的含量,例如预处理12 h达最低值0.536 μmol?g-1,为同时刻对照2.055 μmol?g-1的24%,显著差异;同时提高了体内抗性相关酶POD活性,例如预处理72 h活性高达11.94 μg?mg-1?min-1,而对照在24 h后即已检测不出POD活性。SOD的活性也呈现较高水平且一直维持在相对较高水平。例如经预处理再接高浓度毒素液72 h后,SOD活性高达12.8 μg?mg-1?min-1,而对照在24 h后也检测不出SOD活性。从而缓解了黄萎病菌毒素液对棉花的侵害,提高棉花的抗病性。【结论】适宜浓度（1﹕50）的黄萎病菌毒素液可以做为生物激发子成功地诱导棉花对黄萎病的系统获得抗性。     

提高山羊卵丘细胞核移植效果的研究

 【目的】提高山羊卵丘细胞核移植效果。【方法】采用秋水仙胺提高山羊卵母细胞去核率,5-氮-2'-脱氧核苷（5-aza-dC）和曲古菌素A（TSA）影响山羊卵丘细胞核移植胚胎。【结果】0.5 μg?ml-1秋水仙胺处理山羊卵母细胞效果最好,胞质突起率达91.7%（P＜0.05）;通过比较盲吸去核法与化学辅助去核法的去核率及构建卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现,化学辅助去核法的去核率达100%,所构建的重构胚体外发育能力较高,桑椹胚率和囊胚率分别达25.2%和13.1%,显著高于盲吸去核法（P＜0.05）。采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC处 理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率和囊胚率分别达30.4%和17.0%,显著高于其它各组（P＜0.05）;采用 400 nmol?L-1TSA处理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率、囊胚率分别达31.5%和15.2%。【结论】化学辅助去核法的去核率显著高于盲吸去核法,采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC或400 nmol?L-1 TSA处理山羊卵丘细胞,效果最佳。     

鸡肉钙激活酶与其它畜禽肉中钙激活酶 对钙离子浓度敏感性的比较

 【目的】研究鸡肉中钙激活酶的种类和性质,并与其它畜禽肉以及鱼肉中钙激活酶对钙离子浓度敏感性进行比较。【方法】提取宰后0 d鸡胸肉中的钙激活酶,通过硫酸铵沉淀和透析的方法对鸡肉钙激活酶进行纯化,采用活性电泳的方法检测钙激活酶种类和活性。通过设置0、0.01、0.03、0.05、0.10、0.50和5.00 mmol·L-1的钙离子浓度,比较鸡肉、鱼肉、鸭肉、兔肉、猪肉、牛肉在宰后0 d肉样中不同种类的钙激活酶对钙离子的敏感性。【结果】禽肉鸡肉、鸭肉中μ-钙激活酶的电泳迁移率小于哺乳类兔肉、猪肉、牛肉,当Ca2+浓度从0.01 mmol·L-1升到0.03 mmol·L-1时,兔肉、猪肉和牛肉μ-钙激活酶活性增加,但鸡肉和鸭肉钙激活酶活性没有改变（P>0.05）,说明禽类μ-钙激活酶对钙离子的敏感程度高于哺乳类;在禽类鸡肉、鸭肉中存在另外一种钙激活酶,其对钙离子的敏感性介于哺乳动物中的m-钙激活酶和μ-钙激活酶之间,并且它在禽肉中的活性分别占67.4%和88.4%。【结论】鸡肉中的钙激活酶对钙离子浓度敏感性高于哺乳类。     

木薯粉及制品中高灵敏度AFB1快速检测方法研究

【目的】基于酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测原理,建立高灵敏度的直接竞争法检测木薯粉及其制品中的黄曲霉毒素B₁（AFB₁）,为木薯食品安全提供技术支持。【方法】通过对AFB₁抗原结构改造、免疫和细胞融合等过程获得抗原抗体,建立高灵敏度检测方法,并进行木薯粉及其制品样本的实例验证。【结果】制备的AFB₁抗原和抗体,其抗体亚型均为IgG₁,灵敏度最高的3F2细胞株产生的抗体对黄曲霉毒素G₁、G₂和B₂交叉反应率分别为21.4%、1.9%和8.8%,且对其他毒素类无交叉反应,建立的ELISA线性区间为0.02~0.48 μg/kg,半数抑制浓度（IC₅₀）为0.047 μg/kg,标准方程为y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）。以35%甲醇水溶液作为标准品稀释液,木薯食品原料用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl作为提取液,含油脂的木薯糕点用70%甲醇水溶液作为提取液,所有样本均为10倍稀释,检测限0.2~4.8 μg/kg,样品添加回收率81.5%~120.0%,变异系数均小于8.5%。应用验证试验表明,自建ELISA试剂盒对96份样本检出19份阳性样本,购买试剂盒检出7份阳性,大于2.0 μg/kg的样本检测结果完全符合,自建ELISA试剂盒方法灵敏度优于购买的ELISA试剂盒。【结论】本研究建立的直接竞争ELISA方法灵敏度高,操作简单,可广泛应用于木薯粉及其制品样本中AFB1的快速测定。     

辐解产物2-十二烷基环丁酮的测定方法

 【目的】建立1种含脂辐照食品中特异性辐解产物2－十二烷基环丁酮的萃取分离以及定量分析的新方法。【方法】采用硅胶层析柱萃取分离、气相色谱－质谱联用检测,对淋洗剂浓度、硅胶活化程度、收集时间及气相色谱-质谱条件等技术参数进行优化。【结果】该方法对2－十二烷基环丁酮标准品的最低检出限为0.005 mg?L-1,0.1～2.0 mg?L-1的添加回收率为75.9%～103.9%,相对标准偏差（RSD）均小于5.7%。【结论】与欧盟标准方法EN1785进行比较,硅胶柱分离法具有成本低、提取效率高、重现性好、检出限低、承载样品量大等优点。     

诺氟沙星ELISA试剂盒研制与性能鉴定

【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

水培条件下硫素营养对粳稻米质的影响

 【目的】探讨水培条件下,硫素营养对粳稻稻米品质的改善作用,明确其品质指标随硫素浓度改变而变化的规律,以期提高人们对硫肥的重视,为硫肥的精确合理施用奠定理论基础。【方法】以粳稻武粳15和武育粳3号为材料,采用水培法,研究硫素营养对粳稻稻米品质指标的影响。【结果】在适宜营养液硫浓度下,武粳15和武育粳3号的稻米品质得到显著改善。武粳15和武育粳3号分别在200 μmol?L-1和260 μmol?L-1硫浓度处理下,加工品质、外观品质指标得到显著改善,与对照相比,胶稠度分别增加了12.1 mm和8.4 mm。在米粉糊化特性上,武粳15在200 μmol?L-1硫处理的米粉峰值粘度较对照增加143 cP,消减值降低290 cP。武育粳3号在260 μmol?L-1硫浓度处理下,米粉的峰值粘度较对照增长158 cP,消减值降低34 cP。两个品种籽粒蛋白质含量及总游离氨基酸含量随硫浓度的升高呈增加的趋势,4种蛋白组分含量与硫浓度总体上呈正相关关系。【结论】200 μmol?L-1硫处理的武粳15和260 μmol?L-1硫浓度处理的武育粳3号,其品质相关理化指标得到较好的改善。     

气相色谱-串联四极杆质谱测定餐厨废弃物中的丙烯酰胺

【目的】建立气相色谱-串联四极杆质谱（GC/MS/MS）检测餐厨废弃物中的丙烯酰胺。【方法】样品经去离子温水提取结合C18 SPE小柱净化或者经甲酸溶液提取/Carrez试剂预处理,MCX柱净化的两种前处理方法进行前处理,然后经过衍生反应,利用气相色谱串联三重四极杆质谱检测,在SRM检测模式下,以离子对m/z       152＞135和m/z 152＞107为定性离子对,m/z 152＞135为定量离子,碰撞气体能量15 V,外标法定量。【结果】该方法在3.0-30 ng•L-1浓度中呈现良好的线性关系,相关系数R2=0.9984,丙烯酰胺的检出限值为1.0 ng•g-1（S/N=3）,回收率为95.3%-108.1%,3个水平添加下的相对标准偏差（RSD）均小于4.3%。【结论】所建立的方法稳定、灵敏度高,可用于餐厨废弃物中丙烯酰胺的测定。