鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞发校瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ、４ＡＦ１、６ＤＨ及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ６２株单抗牧场卉性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩ     

抗小鹅瘟病毒中和性单克隆抗体研制及实验防治效果

用淋巴细胞杂交瘤技术研制出１１株抗小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）单克隆抗体。这些单抗仅与ＧＰＶ反应，与其它细小病毒（ＣＰＶ、ＦＰＶ、ＰＰＶ）和其它禽病毒（ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＤＨＶ、ＤＰＶ）均不反应。腹水单抗的ＥＬＩＳＡ效价达１０－５～１０－７，琼扩沉淀效价达１∶２０～１∶５１２，鹅胚中和效价达１∶３０～１∶１２２，鹅体中和效价为１∶５４～１∶９６。ＧＰＡ１和ＧＰＣ５２株单抗对人工感染ＧＰＶ的雏鹅具有良好防治效果。     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．单抗抗原结合位点分析表明４Ｄ１１和３Ｇ１２两单抗作用于同一抗原决定簇     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒提纯病毒粒子免疫ＢＡＬ Ｂ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有稀释法克隆,成功获得了２株ＢＢＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１：６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ ４４．７ｋＤ的外壳蛋白     

钩端螺旋体七日热血清型(56610)特异性单克隆抗体的研制

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤．抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类．     

钩端螺旋体七日热血清型（56610）特异性单克隆抗体的研制

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬ Ｂ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤。抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类。     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交     

新颖抗猪流行性腹泻免疫制剂

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ），通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得结构较为完整的病毒颗粒，病毒ＥＬＩＳＡ效价为１：３×１０＾５，蛋白含量为３．９６ｍｇ／ｍＬ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ筛选并进行３次再克隆，阳性率达１００％，共获得１５株能稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。其染     

鸡传染性支气管炎（IB）诊断方法的研究

本试验用鸡胚大量繁殖鸡传染性支气管炎病毒,收集尿囊液,用１％胰蛋白酶处理制备ＩＵＢＶ血凝抗原,建立了血凝－血凝抑制检测ＩＢＶ抗体的方法,其特异性强,操作简便。另外,本试验建立Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法用于检测ＨＢＶ,病料经处理后,点样于硝酸纤维素膜,加兔抗ＩＢＶ抗体,经ＰＰＡ－ＤＡＢ－Ｈ２Ｏ２显色,其检测结果与双抗体夹心ＥＬＩＳＡ的检测结果一致。     

沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的定位

用淋巴细胞杂交瘤技术研制成４株沙门氏菌属特异单抗ＣＢ８，ｄｅ７，ｃｃ６，ＤＤ４，在免疫转印试验中，证实它们所识别的抗原表位位于鞭毛蛋白上，ＥＬＩＳＡ相加试验及竞争试验显示，ＣＢ８和ｃｃ６与ｄｅ７，ＤＤ４识别的抗原表位不同，表明鞭毛蛋白的属共同抗原具有多种表位的特性。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以提纯的IBV-M病毒抗原免疫BALB/C小鼠,末次免疫后三天取脾细胞与SP_2/O细胞在50％PEG2000作用下融合,三次融合两次获得成功。经抗体检测、筛选和克隆化培养,最后获得三株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。三株杂交癌细胞经体外连续传代培养2个多月,以及液氮冻存4个月后复苏培养,仍能稳定地分泌抗体。     

Characteristics of Monoclonal Antibody Against Infectious Bursal Disease Virus

Thirteen strains of monoclonal antibodies(McAbs) against infections bursal disease virus(IBDV) were obtained by using hydridoma technique and their characteristics were studied by double immunodiffusion,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),virus neutralization test(VNT) and Western-blotting assay (WBA).The result showed that nine of the thirteen McAbs belonged to IgG class and four of them belonged to IgM class.No crossreactions were detected betwween the McAbs and Newscastle disease virus (NDV),infectious bronchitis virus(IBV) and Marek‘s disease virus(MDV).All of McAbs were positively specific reactive with IBDV and five of them can neutralize viral infectivity.Their recognized epitopes of the neutralizing McAbs were all presented on VP2 of the IBDV.     

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体特性的研究

试验采用琼脂免疫双扩散 ,酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,病毒中和试验和 Western-blotting试验对 13株单克隆抗体 ( Monoclonal Antibody,Mc Ab)的特性进行了研究。试验结果表明 ,其中 9株 Mc Abs为 Ig G类 ,4株为 Ig M类 ;这些 Mc Abs仅与抗传染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)发生特异结合 ,而与新城疫病毒 ( Newcastle DiseaseVirus,NDV)、传染性支气管炎病毒 ( Infectious Bronchitis Virus,IBV)和马立克氏病病毒 ( Marek'sDisease Virus,MDV)均不发生交叉反应 ,有 5株 Mc Abs具有中和 IBDV的活性 ,这 5株有中和活性的 Mc Abs识别的抗原位点在 IBDV的 VP2 上     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

伊氏锥虫单克隆抗体制备及性质研究

本研究运用杂交瘤技术成功地分离了B_8、I_2两株分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体(McAb)的细胞系。首先用可溶性伊氏锥虫抗原接种BALB/C小鼠,经过一定的免疫程序后,取其脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,经过两次有限稀释法克隆,用ELISA方法选育出B_8、I_2两株产生抗伊氏锥虫McAb的细胞株。用琼脂扩散法与标准羊抗鼠亚类血清反应证明两种McAbs皆隶属于IgG_1亚类。细胞株在连续传代及冻存复苏后其分泌抗体能力稳定;经多种血清学反应证实,这两株McAb与伊氏锥虫可溶性抗原不起凝集反应,只有ELISA反应阳性。pH稳定试验表明,B_8株McAb比I_2株稳定。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定

以原核表达系统pGEX-6p-1-N/BL21经IPTG诱导表达的重组PEDV N-GST融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,用原核表达系统T12-pPROHTa/BL21经IPTG诱导表达的PEDV N蛋白做筛选抗原,通过间接ELISA进行筛选,获得两株抗PEDV N蛋白杂交瘤细胞,命名为2E3、4C6。亚类鉴定为IgG1和IgG2a型,均为к链抗体,染色体数平均为(91±7)对。用制备的单抗与pGEX-6p-1-N/BL21、T12-pPROHTa/BL21诱导表达后的菌体裂解物做Western Blot试验,在不同载体表达的N蛋白处出现明显的特异性条带;通过间接ELISA做病原检测,这两株单抗不与TGEV、PRV和PrV发生交叉反应,而与PEDV显示良好的特异性反应。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病原特性与多肽分析

从患传染性腺胃病的病鸡中分离到4 株病毒,其中H95株在SPF鸡胚上已稳定传代。病料及H95 传代后的鸡胚尿囊液经蔗糖梯度和CsCl密度梯度离心后的纯化物,电镜下为大小80～160 nm 、有囊膜的病毒颗粒,囊膜表面有纤突,呈冠状形态。病毒在CsCl中的浮密度为1.19～1.23 g/cm 3, 对热和氯仿敏感,耐酸,能抵抗1% 胰酶,无直接血凝性,经卵磷脂酶C处理后的病毒则能凝集鸡红细胞,能干扰新城疫病毒在鸡胚上的增殖。应用杂交瘤技术筛选出4 株抗H95株的阳性克隆,经Western blotting, 其中3 株单抗能识别54 kd 蛋白多肽,该条带也能与来自鸡传染性支气管炎病毒(IBV) M41 株的针对N 蛋白的单抗反应。中和试验表明, H95株与其它IBV 毒株在血清型上存在差异。上述研究结果初步表明,鸡传染性腺胃病的病原是冠状病毒科的成员,并且很可能是鸡传染性支气管炎(IB)中以腺胃病变为主要特征的一种新的致病病型。     

IBV S1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法,以IBVM41毒株的S1基因为模板扩增出了大小为468bp的目的片段(命名为poly156S1),该片断保守性、抗原性较好。将获得的目的基因定向克隆到表达载体pET-32a-c(+)中,获得了重组质粒pET-32a-c(+)-poly156S1。将该重组质粒转入表达菌Origami(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,获得了大小约为34KD的重组蛋白poly156S1。Western-blot证实该重组蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。用纯化好的重组蛋白poly156S1免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行单克隆抗体的制备,成功获得了针对M41S1蛋白的3株单克隆杂交瘤细胞8D2、8D6、10F9,其IgG亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型。按常规方法对各株单克隆杂交瘤细胞进行了小鼠腹水单抗的制备与纯化,并用以重组蛋白poly156S1为包被抗原的间接ELISA对纯化后的腹水单抗进行了效价测定,及其与重组蛋白poly156S1亲和力的分析。结果表明:腹水单抗8D2、8D6、10F9的ELISA效价分别达到1.78×218,1.37×221,1.31×216;单抗8D6与重组蛋白poly156S1的亲和力最高。Western-blot进一步证实单抗8D6与重组蛋白poly156S1具有良好的反应性。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

分泌抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

利用超滤膜超滤浓缩法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)疫苗株 D78免疫 BALB/ c小鼠。取其脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选克隆 ,成功地建立了 13株分泌抗 IBDV D78的杂交瘤细胞株 ,这些杂交瘤细胞株的稳定性好、特异性强 ,腹水和无血清培养上清 (浓缩 30倍 )中 Mc Abs的效价分别达 16 6和 10 3以上