人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究

为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。     

膜表达型InsB_(15-23) H-2K~d dtSCT诱生小鼠特异性CTL细胞研究

通过SOE-PCR构建膜表达型二硫键捕获型单链三聚体(dtSCT)真核表达载体,肌肉免疫4~5周龄NOD母鼠,利用流式细胞术检测小鼠外周血和脾脏中InsB15-23特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞频率。结果表明:dtSCT组NOD小鼠的外周血中InsB15-23特异性CD8+T细胞频率为1.93%±0.55%,与空质粒对照(0.22%±0.11%)有极显著差异(P0.01);脾脏中InsB15-23特异性CD8+T细胞频率为0.83%±0.31%,与空质粒对照(0.37%±0.20%)亦有极显著差异(P0.01)。说明膜表达型InsB15-23H-2Kd dtSCT分子在小鼠体内得到表达,且具有类似天然pMHC I复合物的功能,能够为InsB15-23特异性CTL细胞的活化增殖提供第1信号。     

bcr-abl融合基因片段和mIL-7基因双表达载体的构建与表达

利用重组DNA技术构建bcr-ab l融合基因片段和m IL-7基因双表达载体pV bcr-ab l/m IL 7,转染CHO细胞,通过IFA检测bcr-ab l融合基因片段和RT-PCR检测m IL-7基因,以探讨基因的双表达情况。结果表明:成功构建了双表达载体pV bcr-ab l/m IL 7,并检测到bcr-ab l和m IL-7在真核细胞的暂态表达,这为慢性粒细胞白血病bcr-ab l融合基因疫苗的研究提供了新的工具。     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.     

耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建

为克隆和研究淋球菌耐药相关基因，分别从耐药性淋球菌菌株RSM292C4和WHO标准参考淋球菌株WHO-A细胞中提取DNA，用RsaⅠ酶切成400-600bp的片段。将酶切耐药菌株基因DNA片段分别与不同的接头连接，再与标准参考菌株DNA进行消减杂交及抑制性PCR检测，将所得PCR产物与克隆载体连接，构建差异DNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，获得2500个克隆。随机挑取96个制备质粒进行PCR检测，均扩增出100-600bp大小的片段。耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆耐药淋球菌特异的未知新基因奠定了基础。     

BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测

以BCR-ABL融合蛋白氨基酸序列为基础,采用EMBOSS软件及DNAstar软件结合Hopp and Woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合蛋白(p210~(BCR-ABL))融合区的B细胞表位进行预测。结果表明:BCR-ABL蛋白融合区位于B细胞表位内,该表位含有α-螺旋和无规则卷曲结构。BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测的研究对应用合成肽抗原制备融合区单克隆抗体具有重要的指导意义。     

可溶性MICA对外周血淋巴细胞受体NKG2D、CD69表达的影响

为了分析可溶性MHCⅠ类相关分子A(sM ICA)对淋巴细胞活化性受体NKG 2D及早期活化标志性受体CD 69表达的影响,从U 937细胞中经RT-PCR扩增出sM ICA的cDNA片段,经酶切后插入原核表达载体pQE 3.1,并命名为pQEM ICA。IPTG大量诱导表达后溶解包涵体,所得6个H is重组蛋白经N i 树脂纯化、稀释复性,最后与外周血单个核细胞作用。结果发现sM ICA蛋白可抑制NKG 2D的表达,并通过NKG 2D的下调而抑制CD 69的表达。该研究不仅为探讨sM ICA分子对淋巴细胞特别是NK细胞生物学特性影的研究响奠定基础,也为探讨M ICA介导的肿瘤免疫逃逸机制提供工具。     

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。     

大肠杆菌菌影制备及介导pEGFP-N1在RAW264.7细胞中表达

通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E,并将其插入到温控表达载体pBV220中,构建重组温控表达质粒pBV220-E。将重组质粒pBV220-E转化至大肠杆菌DH5α中,升温到42℃诱导E基因的表达。将真核表达质粒pEGFP-N1与大肠杆菌菌影孵育后转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,荧光显微镜观察pEGFP-N1的表达情况。结果表明:扩增的E基因全长为276bp,与GenBank公布的基因序列一致。电镜观察结果显示,细菌表面出现跨膜孔道,细菌内容物经孔道排出形成空壳。荧光显微镜观察结果显示,大肠杆菌菌影介导的pEGFP-N1在小鼠巨噬细胞中获得表达。为进一步研究以细菌菌影为基础的新型灭活疫苗和载体疫苗提供参考依据。