高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的差异蛋白

【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-145细胞感染PRRSV后,热休克蛋白70和S100钙结合蛋白A6表现为下调,而硫氧还蛋白、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白表现为上调。功能预测分析发现,5个蛋白与MARC-145细胞抗应激、抗氧化、生长、凋亡和信号转导等作用息息相关。【结论】高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后,能诱导细胞部分功能蛋白表达量的增加或减少。     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。     

核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒复制中的作用

为研究宿主细胞核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respir-atory syndrome virus,PRRSV)复制中的作用,本研究通过荧光定量PCR和Western-blotting等方法,检测了PRRSV感染对Marc-145细胞中RPL12表达的影响,以及过表达或敲减RPL12对PRRSV复制的影响.结果显示,PRRSV感染可上调Marc-145细胞中RPL12基因的表达.过表达RPL12可促进PRRSV的复制,而敲减RPL12可抑制PRRSV的复制.通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜检测,进一步研究发现RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,并共定位于细胞质中.本研究首次发现了宿主蛋白RPL12能够促进PRRSV复制,并与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,为进一步研究PRRSV的感染与复制机制以及与宿主的相互作用提供了新的切入点,为抗病毒药物的研发提供了有益的探索.     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克...     

猪乳外胞体总miRNAUnit对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制抑制的研究

通过对猪乳汁Exosome中总miRNA进行分离提取,以验证其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抑制作用。首先提取猪乳汁中的Exosome,并将提取的Exosome对感染PRRSV的MARC-145细胞进行初步处理,于24、48 h后进行病毒滴度测定,并在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察;随后对猪乳Exosome中的总miRNA进行进一步提取,用提取的总miRNA处理感染PRRSV的Marc-145细胞,于24、48 h后进行病毒滴度测定,同时也在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察。结果表明,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA细胞中的PRRSV滴度都显著低于转染PBS(阴性对照);同时相对于阴性对照组,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA的细胞形态排列较紧密,边缘较清晰整齐。说明猪乳Exosome中存在与抑制PRRSV复制有密切关系的miRNA,本研究将为PRRS的预防和治疗提供新的理论依据和途径。     

猪ESD真核表达质粒的构建及其抑制口蹄疫病毒复制的研究

[目的]探究猪ESD蛋白的抗病毒功能,通过构建猪ESD真核表达质粒,研究其是否能够抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增出猪的ESD基因,构建到pc DNATM3.1/Myc-His A真核表达载体上。通过Western blotting和实时定量PCR检测ESD蛋白的表达情况及其抗病毒功能。[结果]获得了猪ESD真核表达载体,转染后能够正常表达。FMDV感染PK-15细胞后,ESD转录水平显著上调;过表达ESD蛋白显著抑制FMDV的复制;下调表达ESD蛋白显著促进FMDV的复制。[结论]猪ESD蛋白能够抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。     

抗蓝耳病shRNA转基因表达载体的构建与功能验证

将靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24 h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.试验结果表明:所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.     

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。     

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。     

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一.从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定.结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达.这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据.     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因重组DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

【目的】利用DNA改组技术（DNA shuffling）对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。【方法】利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46（ORF5基因重组的DNA疫苗）免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组（经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组）和pCA-ORF5-MLV组（ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV）,评估其免疫效果。【结果】筛选到2个去除信号肽的重组突变体（ΔORF5-8和ΔORF5-46）。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4（IL-4）和干扰素γ（INF-γ）含量均极显著提高（ORF5＜0.01）,脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强（ORF5＜0.01）,均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体（抗体平均滴度为10～16）。【结论】重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定

根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。     

NMRAL1对流感病毒复制的调控机制

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。     

利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造;设计特异性引物,分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列;采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游,获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A;再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】成功获得了19 112bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体,将其直接转染MARC-145宿主细胞后,经细胞体内转录合成病毒基因组RNA,获得了拯救病毒(rCH-1A);病毒生长特性试验结果显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】建立了一种方法简单,操作方便,节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。     

乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用

【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6/7基因真核载体的构建

针对PRRSV ORF5～ORF7设计3对特异性引物,以PRRSV GD-XH株和GD08-1株为模板进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7),然后将重组表达质粒转染Marc-145细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7)和载体pEGFP-N1均有绿色荧光出现.结果表明:成功构建了表达PRRSV GD-XH株和PRRSV GD08-1株的GP5、M、N蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1-GD-XH-GP、pEGFP-N1-GD-XH-M、pEGFP-N1-GD-XH-N、pEGFP-N1-GD08-1-GP5、pEGFP-N1-GD08-1-M、pEGFP-N1-GD08-1-N.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化，对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示，PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1 320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示，这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示，与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路，这些通路主要与宿主免疫有关。综上，PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变，经生物信息学分析，推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。