4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究

[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。     

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。     

PK-15细胞中与CSFV感染相关的microRNAs筛选及miR-214的功能研究

【目的】利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟(classical swine fever,CSF)的防控提供新依据。【方法】为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA。挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用。CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平。为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度。为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1相关的死亡区域蛋白(TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD),因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响。【结果】CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显。qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果。将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV, CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制。为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD。转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达。通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡。【结论】CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达。miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制。     

口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。     

猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备

[目的]通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌（Rosetta）,进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体.[结果]STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒pET-STAT-1o,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达.STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达.[结论]制备获得的猪STAT-1 α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌（Rosetta）表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应.     

稳定表达猪Viperin的PK-15细胞系的构建与鉴定

为了探讨先天免疫效应因子Viperin的抗病毒作用,从猪外周血单核细胞中成功扩增了猪Viperin基因完整阅读框,克隆到真核表达载体p EGFP-C1中构建重组表达质粒p EGFP-Vi。阳性质粒经PCR、酶切和测序鉴定后通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染PK-15细胞,荧光显微镜观察发现融合蛋白质EGFP-Viperin定位于细胞质中,不同于对照质粒EGFP在细胞中的均匀分布。共聚焦检测结果表明,重组蛋白质主要定位于细胞的内质网上。Western blot检测结果表明,猪Viperin蛋白质在PK-15细胞中以融合蛋白质的形式稳定表达,分子量约为7.0×104。     

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

猪伪狂犬病毒引起PK-15细胞自噬的研究

[目的]研究猪伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾传代细胞系(PK-15)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬在PRV感染复制过程中的作用。[方法]采用Western blot、透射电子显微镜(TEM)、激光共聚焦、siRNA转染等方法研究了PK-15细胞感染PRV后的细胞自噬。利用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分析自噬对病毒复制的影响,再通过沉默自噬相关基因Beclin-1,进一步观察自噬对PRV复制的影响。[结果]PRV感染PK-15细胞后,LC3-Ⅰ显著转化为LC3-Ⅱ,PK-15细胞内自噬小体的数量明显增加。PRV感染增加了LC3阳性斑点的细胞数。同时,变异毒株PRV ZJ01与传统毒株PRV LA诱导的自噬存在差异。自噬的药理学变化试验和siRNA转染结果还显示自噬能够促进PRV的复制。[结论]PRV感染PK-15细胞可以诱导自噬并有利于病毒的复制。     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。     

保护地茄果类蔬菜落花落果的原因及防治对策

从自身原因和外部环境条件两方面分析了保护地蔬菜落花落果的主要原因,提出防治措施,有效控制落花落果的发生。     

灌水和过量施钾对烤烟养分含量及烟叶产量品质的影响

采用田间试验研究了灌水和过量施钾对烤烟（Nicotiana tabacum L.)养分含量和产量品质的影响。结果表明，在烤烟N：K2O用量比达到1：3的基础上随钾用量增加，烟株体内营养元素含量、烟叶产量和化学成分均没显著差异，灌水可以显著提高烟叶产量和上等烟比例，但灌水与钾用量互作对烤后烟叶养分含量和化学成分的影响不显著。     

万寿菊病虫害的发生与防治措施

万寿菊又名金盏花、臭芙蓉 ,千寿菊、蜂窝菊 ,属菊科万寿菊属一年生草本植物。黑龙江省八五三农场人工栽培万寿菊主要是取其花朵作为提取黄色素的原料。在正常条件下 ,种植万寿菊可实现公顷产鲜花 2 2 .5t以上、产值可达 135 0 0元左右、利润可达6 0 0 0元左右 ,经济效益较好。     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。     

植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施

以农杆菌渗入烟草表皮瞬间表达绿色荧光蛋白的观察实验为例,对植物学与分子生物学研究创新型实验的选题设计、教学过程和效果进行了探讨。该实验项目的实施培养了学生的团队精神、科学素养和创新意识,提高了实验设计和实际操作能力,是生物科学特色专业实验教学改革的有益尝试。     

耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192的筛选、鉴定及酶学性质

为了提高厌氧水解效率,采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192.经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),对其产酶条件进行了初步研究.结果表明,该茵的最适生长温度为30℃,生长8～12h达对数期,初始pH 7.5时酶活力最高.蛋白酶最适反应温度为45℃、pH 7.0,酶活力最高达39.3 U/mL.该酶在50℃以下,pH 6.0～9.0性能稳定.在60℃以上热稳定性很差,70℃保存lh酶活力全部丧失.