| 猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备 |
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| 引用本文： | 赵祥秀,黄茂发,高跃美,唐榕泽,胡仁俊,梁晶晶,李晓宁,罗廷荣.猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备[J].南方农业学报,2020,51(12):3099-3108. |
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| 作者姓名： | 赵祥秀 黄茂发 高跃美 唐榕泽 胡仁俊 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 |
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| 作者单位： | 广西大学动物科学技术学院,南宁 530004;亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁 530004 |
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| 基金项目： | 国家重点研发计划项目广西自然科学基金项目国家自然科学基金项目 |
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| 摘 要： | 目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.
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| 关 键 词： | IKKγ 猪瘟病毒(CSFV) 原核表达 真核表达 多克隆抗体 |
Expression of porcine IKKγ in prokaryotic and eukaryotic expression systems and preparation of polyclonal antibodies |
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| ZHAO Xiang-xiu,HUANG Mao-fa,GAO Yue-mei,TANG Rong-ze,HU Ren-jun,LIANG Jing-jing,LI Xiao-ning,LUO Ting-rong.Expression of porcine IKKγ in prokaryotic and eukaryotic expression systems and preparation of polyclonal antibodies[J].Journal of Southern Agriculture,2020,51(12):3099-3108. |
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| Authors: | ZHAO Xiang-xiu HUANG Mao-fa GAO Yue-mei TANG Rong-ze HU Ren-jun LIANG Jing-jing LI Xiao-ning LUO Ting-rong |
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