猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

杜梨不定根形成相关基因PbARRO-1的克隆及定量表达分析

以杜梨叶片为试材,采用同源序列和RACE技术克隆了梨ARRO(adventitious rooting related oxygenase)基因,并进行了基因的生物信息学和时空表达分析,以期对梨属植物不定根产生研究提供帮助。结果表明:PbARRO?1基因开放读码框全长831bp,编码276个氨基酸,相对分子量为30.535 9kD,等电点pI为5.53;推导氨基酸序列同源性分析显示该基因与苹果、梅花、毛果杨等具有较高同源性,其中苹果达到92%。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在秋子梨根、茎、叶中均有表达,叶片中表达量初期较高,后期较低;茎中表达量则呈现先升高后降低的趋势,在第15天达到峰值,推测PbARRO-1基因与茎上不定根的形成密切相关。     

小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.     

基于区间两阶段鲁棒优化模型的灌区水资源优化配置

为避免由灌区水资源配置系统存在的诸多不确定因素导致的配水过程风险性,在区间两阶段随机规划方法的基础上加入了鲁棒优化方法,构建区间两阶段鲁棒优化模型,引入鲁棒系数表示系统风险,将系统风险体现在模型中,克服了系统风险不可控的不足。以三江平原牡丹江灌区为例,对灌区水资源进行优化配置,得到灌区多水源、多作物、不同鲁棒系数下的配水目标。结果表明:随着鲁棒系数增大,导致缺水量增加,系统稳定性增强,但成本也随之增加,系统经济性降低;当鲁棒系数为3时,缺水量不再增加,系统达到稳定的状态,此时系统的成本在[1. 903 27×10~9,2. 634 75×10~9]元之间变化。优化结果可为决策者提供决策空间,为农业水资源的合理配置提供技术支持。     

河沙改良土壤对烤烟生长及产质量的影响

为解决罗平地区部分植烟土壤板结、粘重问题,通过掺入河沙对烟叶农艺性状、产质量及主要化学成分指标的影响试验研究了土壤改良对烤烟生长及产质量的影响。结果表明：在土质较为粘重田地上,每个烟塘施用河沙2、3、4 kg处理的农艺性状较对照和施用河沙1 kg处理的要好,烟叶产量、产值、均价、上等烟比例也明显增高;每塘施用河沙3、4 kg能提高烟叶水溶性总糖、还原糖和K2O含量,降低烟碱含量,而塘施河沙1、2 kg处理对化学成分影响不明显。     

小杂粮在宁夏区域经济发展中的地位和作用

1宁夏小杂粮种类和分布 小杂粮是指生育期短，地域性强，种植方法特殊，面积较小，有特殊用途的小宗粮豆，包括豆类（豌、扁、蚕豆，草豌豆、芸豆、绿豆、红小豆），粟类（如糜子、谷子），麦类（大麦、莜麦、青稞、高粱等）和荞麦类（甜荞、苦荞）等数十种。宁夏山区主要有豌豆，蚕豆，扁豆，草豌豆，糜子，谷子，荞麦，莜麦8种，高粱原来银川平原种植，近年面积大幅度减小，山区种植以产草为主。     

关于返贫问题研究

甘肃省农村扶贫从1955年中部地区享受国家返销粮开始,到70年代初这种救济工作达到了高潮.大量及时的救济,在帮助群众克服生产、生活困难方面起到了积极作用,但是无法从根本上解决问题.……     

MicroRNA研究概述

MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性非编码的单链小分子RNA,长约21nt~23nt。越来越多的miRNA在动物细胞和植物组织中发现,这些成熟的小分子RNA是从具有发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)剪切出来,通过与靶mRNA分子互补结合而抑制蛋白翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因的表达。miRNA是一类重要的基因调控子,在机体的基因表达调控、细胞分化和凋亡以及抗病毒防御中发挥重要的作用。深入理解miRNA介导的宿主与病毒之间的相互调节作用,对于阐明病毒的致病机理与制定治疗策略具有深远的意义。     

集体土地产权制度改革问题探讨

我国农业生产力的发展水平很低,不能满足建立社会主义生产方式所要求的基础条件。主要表现为集体土地产权制度及其实现形式明显不适应农业生产力的发展水平。农业生产力的不断提高是农业和农村可持续发展的核心内容,因此,深化集体土地产权制度改革是促进农业可持续发展和农村发展的必要条件。     

鸡褪黑激素受体基因在开产前后不同组织中的表达差异

为了从分子水平上了解鸡褪黑激素受体（MTNR）基因在开产前后不同组织中的表达差异,以β-actin基因为内标基因,运用实时荧光定量PCR方法,比较了MTNR1A、MTNR1B和MTNR1C这3个受体基因在心脏、肝脏、输卵管、卵巢、脑和视交叉各组织及在鸡开产前后表达量的差异。结果表明,MTNR1A只在开产后各组织中的表达量存在差异,其中以卵巢组织表达量最高,心脏中表达量最低。MTNR1B和MTNR1C的表达量在开产前或开产后均表现出组织间的显著差异;在开产前后的各组织中,MTNR1B的表达量均以视交叉为最高,卵巢为最低;而MTNR1C的表达量在开产前以心脏中最高,开产后在视交叉中最高,在卵巢组织中的表达量开产前后均为最低。同一组织开产后与开产前比较,MTNR1C基因在心脏、输卵管和脑组织中的表达量呈显著下调趋势。因此,3个受体基因在鸡的不同组织和生理时期存在表达差异。