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1.
[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持. 相似文献
2.
参考GenBank上发表的猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus2,PCV2)全基因组序列,设计一对引物,通过反向PCR技术扩增出9株PCV2流行株的全基因,并进行了序列测定与分析,结果表明:9株PCV2的基因组全长为1768bp或1767bp,同源性比较发现,本研究的9株PCV2之间的核苷酸同源性为95.6%~100%,与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的同源性为95.1%~99.8%,与法国和新西兰代表株的亲缘关系较近,与美国、加拿大和澳大利亚代表株的亲缘关系较远。所得9株PCV2的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为93.1%~100%和91.8%~99.6%,存在较大的变异。 相似文献
3.
RT-PCR技术诊断猪瘟的应用研究 总被引:22,自引:2,他引:20
应用反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT-PCR况对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测,以份诊断为阳性,阳性率62.2%。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共276份,经RT-PCR检测,37份为阳性,阳性率为13.4%。其中健康猪扁桃体带毒较高,246份扁桃体中有35份阳性,占14.2%。采自柳州健康猪的26份淋巴结材料全为阴性,只有邕宁县的1份健猪淋巴结阳性。结果表明,RT-PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断。 相似文献
4.
MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性非编码的单链小分子RNA,长约21nt~23nt。越来越多的miRNA在动物细胞和植物组织中发现,这些成熟的小分子RNA是从具有发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)剪切出来,通过与靶mRNA分子互补结合而抑制蛋白翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因的表达。miRNA是一类重要的基因调控子,在机体的基因表达调控、细胞分化和凋亡以及抗病毒防御中发挥重要的作用。深入理解miRNA介导的宿主与病毒之间的相互调节作用,对于阐明病毒的致病机理与制定治疗策略具有深远的意义。 相似文献
5.
用含有表达NDV HN的重组杆状病毒的汕乳剂苗接种小鸡,可产生血凝抑制反应(HI)和抗NDV的中和抗体。用活的重组病毒接种较用经β—丙内酯灭活的组重病毒接种所获得的HI抗体滴度要高,但较存活的或β—丙内酯灭活的NDVB_1株的HN浓缩 相似文献
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RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究 总被引:24,自引:0,他引:24
本试验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对猪瘟进行诊断应用研究.应用RT-PCR对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测,84份诊断为阳性,阳性率62.2%.从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共276份,经RT-PCR检测,37份为阳性,阳性率为13.4%.其中健康猪扁桃体带毒较高,246份扁桃体中有35份阳性,占14.2%.采自柳州健康猪的26份淋巴结材料全为阴性,只有邕宁县的1份健猪淋巴结阳性.结果表明,RT-PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断. 相似文献
8.
广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析 总被引:4,自引:0,他引:4
参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列,设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术,成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组,将这11个基因片段克隆,并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,核苷酸同源性分别为85.4%、84.6%、88.7%、85.7%、85.7%、85.3%、85.6%、95.3%、85.7%、85.7%85.4%、83.4%、84.3%,推定的氨基酸同源性分别为92.6%、91.7%、94.2%、93.1%、92.9%、92.3%、93.0%、97.7%、92.6%、93.0%、92.6%、90.5%、90.6%。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异,表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析,所比较的14株CSFV被分为2个群:GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ,其余的11个毒株被归为群Ⅱ,GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较,结果显示,基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。 相似文献
9.
三株广西狂犬病病毒NS基因和M基因的克隆与序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究设计了一对特异性引物NSM1/NSM2,对三株广西狂犬病病毒NS和M基因同时进行了RT_PCR扩增、克隆和测序。同源性分析表明,三株广西野毒NS基因核苷酸同源性为87.2%~98.4%,M基因核苷酸同源性为90.1%~99.7%;与固定毒和狂犬病相关病毒比较,NS基因分别为79.9%~82.8%和69.7%~71.0%;M基因的分别为82.8%~87.8%和75.0%~77.8%。三株野毒NS基因氨基酸同源性为93.3%~98.7%,M基因氨基酸同源性分别为97.5%~100%。表明广西各地毒株之间亲缘关系不同,但最为相近;与狂犬病固定毒株亲缘关系较远;与狂犬病相关病毒亲缘关系最远。 相似文献
10.
本实验以来自广西梧州、博自和北海地区的3株猪瘟野毒和中国标准石门株病毒、疫苗毒为材料,研究其在宿主体内和体外PK-15细胞中增殖的基本特性和差异.结果显示,广西的一部分毒株很可能在毒力和生长特性上已经发生了一些变异.本实验用免疫酶实验检测PK-15细胞中的猪瘟病毒抗原,发现其主要存在于细胞的核膜以及内质网和高尔基体富集的区域. 相似文献