表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa~([1])。将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF(moi=0.01),每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体p T-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196—723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10~(6.2)TCID_(50)/0.1m L、10~(5.5)TCID_(50)/0.1m L,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1—5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15—20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10~(3.0)TCID_(50)/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性。荧光重组病毒的构建为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

带移民的二次加权分枝过程的吸收概率

研究了带移民的二次加权马尔可夫分枝过程,得到了吸收概率的相关结果,该结果在排队网络、生物学等诸多领域具有广泛的应用前景。     

可食性膜对贮藏期草莓的保鲜效果

以新鲜草莓为试材,通过单因素试验分析了可食用膜中大豆分离蛋白、甘油、山梨酸钾添加量对贮藏期草莓腐烂率和失重率的影响,在此基础上应用正交实验研究了可食用膜中各成分的最佳浓度组合,以期达到最优的保鲜效果,为探索新型采后处理技术提供参考依据。结果表明:常温贮藏72h后,对照组腐烂率为16.15%,失重率为7.26%,而涂膜保鲜剂处理的草莓腐烂率和失重率分别降为3.80%、1.39%,表明涂膜能有效延长草莓保鲜期。正交实验结果表明,当大豆分离蛋白、甘油和山梨酸钾质量分数分别为5.0%、2.5%和1.0%时,可食性保鲜膜的保鲜效果最佳。     

唐山市加强泵站管理的几点作法

1980年以来，农村全面实行了土地家庭联产承包责什制，国家、集体、个人一度对水利工程投入减少，使水利工程管理工作随之出现了许多不容回避的问题。一是水利工程管理和维修经费严重不足，泵站设备完好率仅达到40％～50％，工程老化失修、效益衰减日益突出；二是农村生产出原来的生产队变为一家一户经营，给水费征收利工程管理运用、维修等工作带来很大困难；三是泵站管理职工家里都大贡仟田，工作精力难以集中，以站为家的观念逐渐淡薄；四挂水利工程管理人员待遇偏低的矛盾日益突出。加强经营符理，努力增加泵站收入刻不容缓。面对这些管…     

仔猪非感染性腹泻的病因分析及防治

分析了仔猪非感染性腹泻存在的依据，着重从营养因素、管理因素和环境因素三方面论述了引起仔猪发生腹泻的主要原因及针对各种原因提出相应的防治措施。     

不同时期添加甜菜碱对肉鸡生产性能和脂肪代谢的影响

36 0只 1日龄健康艾维茵 (Avian)肉鸡随机分为 6组 (每组 6 0只 ) ,分别为对照组和第 、 、 、 、 组 ,试验期7周。第 ～ 组分别于不同时期添加同一剂量的甜菜碱 (10 0 0 mg/ kg,0 .1% ) ,添加时间依次为 1～ 7周 ,2～ 4周 ,3～ 5周 ,4～ 6周 ,5～ 7周。结果表明 :不同时期添加甜菜碱均能促进肉鸡体增重 ,降低腹脂率 ,与对照组相比 ,第 、 、 、 、 组 7周末体质量分别高出 8.0 1% (P<0 .0 1)、5 .0 1% (P<0 .0 5 )、4 .4 7% (P<0 .0 5 )、2 .2 4 % (P>0 .0 5 )、2 .0 9% (P>0 .0 5 ) ;腹脂率分别降低 19.5 6 % (P<0 .0 1)、6 .0 9% (P<0 .0 5 )、13.4 8% (P<0 .0 1)、15 .6 5 % (P<0 .0 1)、12 .17% (P<0 .0 5 ) ;第 组体质量在第 3、4周末超过第 组 ,从 6周龄开始 ,各组间体质量差异逐渐缩小 ;试验组皮脂厚度 ,胸、腿肌中甘油三酯含量较对照组有不同程度增加 (厚 ) ,但肝脏中甘油三酯含量各试验组均低于对照组 ;血清生化指标动态变化呈现一定的规律性 ,其中血清总蛋白含量较稳定 ,总氨基酸含量随周龄逐渐升高 ,甘油三酯 5～ 6周高于 1～ 3周 ,游离脂肪酸含量随周龄呈下降趋势 ,血清尿酸呈现缓 U型变化曲线。结论 :(1)不同时期添加 0 .1%甜菜碱可促进肉鸡体增重 ,降低腹脂率 ,引起体内脂肪重新分     

包裹BSA的线状银为基底探讨小檗碱的拉曼光谱

通过拉曼光谱技术测定了液体小檗碱(Berberine)的常规拉曼光谱(NRS)及表面增强拉曼光谱(SERS),归属了拉曼特征峰,并与固体小檗碱的NRS进行对比,发现特征峰位基本没变.研究小檗碱与纳米银(Ag-Berberine)、包裹牛血清白蛋白(BSA)的线状银(Ag@BSA-Berberine)的拉曼光谱,分析了线性纳米银(Ag)及包裹BSA的线状银(Ag@BSA)对小檗碱的吸附模型.结果显示,线性纳米银对小檗碱、牛血清白蛋白有明显的拉曼增强效应,增强效应主要在线性纳米银与氨基酸中N的孤电子对、甲氧基中的氧、苯环中的π电子及异喹啉中的N发生了吸附作用.对比Ag@BSA-Berberine和Ag-Berberine的特征峰,加了BSA后的拉曼光谱有明显的减弱,但峰位并没有移动,但是有BSA修饰的纳米银的小檗碱拉曼光谱有较高的稳定性,利于小檗碱的进一步研究.     

实验动物粪便中金黄色葡萄球菌和沙门菌检验方法的比较

为探讨实验动物粪便中金黄色葡萄球菌和沙门菌的检测方法,试验比较了国标的方法、ATB生化鉴定试纸条、rRNA测序分析对样品的检测结果,发现生化鉴定试纸条和16S rRNA测序分析均可以准确、高效地检测出沙门菌和金黄色葡萄球菌,而参考国标的方法,有些金黄色葡萄球菌和沙门菌的鉴定结果与国标不一致。试验表明,用ATB生化鉴定试纸条和16S rRNA序列分析检测沙门菌和金黄色葡萄球菌及其他菌的方法更可靠。     

外源病毒检验用抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清的制备与检定

为制备外源病毒检验用抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)特异性血清,对300只3~4周龄的SPF鸡进行基础免疫和加强免疫;最后一次免疫21 d后,采血并分离血清;对血清经混合、分装、冷冻、真空干燥后,进行无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验。结果表明:本研究制备的抗IBV特异性血清的无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定结果均符合现行《中华人民共和国兽药典》规定;血清中和效价为1:800,与IBV H120种毒株的中和指数为106.3,与鸡传染性法氏囊病毒B87株、鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、禽呼肠孤病毒S1133株的中和指数均不大于10;通过AGP、ELISA、HI等试验,确定该血清中不含其他禽源外源病毒抗体。本研究为鸡传染性支气管炎活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。     

抗鸡新城疫病毒特异性血清的制备与鉴定

为制备外源病毒检验用抗鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的特异性血清,对300只3~4周龄的SPF鸡进行了基础免疫和加强免疫。最后一次免疫后21 d采血并分离血清,血清经混合、分装、冷冻真空干燥后,对其进行无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验。结果表明,制备的抗NDV特异性血清无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定均符合现行《中华人民共和国兽药典》规定;血清中和效价为1∶2 089,与NDVLa Sota株毒种中和指数为108.2,与其它禽类病毒的中和指数均不大于10,通过AGP、ELISA、HI等试验确定血清中不含其他禽源外源病毒抗体。该研究为鸡新城疫活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。