非洲猪瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表达及诊断抗原筛选

为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重组蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L,将Ba71V株的K205R、E183L、A104R和B602L基因分别亚克隆进行原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET-E183L、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,纯化表达的蛋白,并进行Western blotting鉴定,结果4种重组蛋白与预期大小一致,且与ASFV抗体发生特异性反应。为了从表达的4种重组蛋白中筛选最佳诊断抗原,将其分别包被酶标板,间接ELISA检测ASFV阳性血清,发现重组蛋白pK205R、p54和pB602L血清学反应良好;在检测ASFV感染后第13天分离血清时,重组蛋白p54和pK205R效果更佳,这表明p54和pK205R重组蛋白是较好的诊断抗原,可用于ASFV感染后早期或中后期血清学诊断。     

鸡大肠杆菌毒力因子的流行病学及药物敏感性分析

采集江苏省不同地区15个鸡场的疑似大肠杆菌感染病例的病料,通过细菌学分离鉴定,共获得45株大肠杆菌,并确定了O78(53.33%)和O109(28.89%)为优势O抗原型。根据Pap菌毛基因设计1对引物,根据文献报道合成2对引物,分别用于Pap菌毛、F1菌毛以及毒力岛HPI的基因检测;通过对45株大肠杆菌分离株的PCR扩增,确定了7株(15.56%)为F1+大肠杆菌,1株(2.22%)为F1+Pap+大肠杆菌,22株(48.89%)为F1+HPI+大肠杆菌,4株(8.89%)为F1+Pap+HPI+大肠杆菌,5株(11.11%)为HPI+大肠杆菌,未发现Pap+菌株。选用7种临床常用的抗菌药对全部菌株进行药敏试验,结果表明:绝大多菌株对呋喃妥因、头孢唑林、多黏菌素B敏感,对环丙沙星和庆大霉素因菌株差异而异,林可霉素、四环素多不敏感。     

应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白

用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证.对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因.结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个.进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX.VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础.     

基因治疗奶牛乳腺炎的生物安全评价

为评价基因治疗奶牛乳腺炎的生物安全性,以3头患隐性乳腺炎的奶牛作为试验对象,通过乳房基部穿刺注射接种携带人溶菌酶基因的乳腺特异性表达重组质粒p215C3LYZ(1 600μg·头~(-1)),24 h后以相同剂量重复注射1次.定期采集试验奶牛的乳样、粪样、尿样以及试验牛舍的垫料和水样,并利用建立的PCR进行检测.结果发现,除第2次注射24 h内可从奶样中检测到重组质粒外,其他样品均为阴性,这表明重组质粒p215C3LYZ不能在奶牛体内长期残留,也不能在环境中释放及散播.所有奶牛均于第2次注射20 d后处死,并采集血液、心、肝,脾、肺、肾、肌肉以及乳腺等样品进行PCR检测,结果表明:重组质粒p215C3LYZ在奶牛体内未发生转移.     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

防治奶牛乳房炎的基因工程新药

奶牛乳房炎是世界范围内发生最普遍、防治最难、花费最多的奶牛疾病之一，对奶牛业的危害主要是发生率高、奶产量降低和医药费用增加。目前奶牛乳房炎主要用抗生素防治，虽有一定的效果，但也日益暴露出耐药菌株和抗生素残留等危害人类健康的严重问题，特别是在我国，由于抗生素的长期、大量和盲目使用，治疗奶牛乳房炎无效的病例越来越多，从而给奶牛业造成了很大的经济损失。     

盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较

为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。     

禽白血病及禽网状内皮细胞增生病感染情况的调查

在江苏省3个鸡场,应用ELISA对禽白血病病毒及禽网状内皮细胞增生病病毒的感染情况做了调查。3个鸡场的所有被检的10个鸡群均感染了禽白血病病毒(ALV),在被检的151只鸡血清中,ALV群共同性P27抗原的阳性率为39.10％(59/151);在3个鸡场中,只有1个场感染了禽网状内皮细胞增生病病毒(REV),在被检的51只鸡血清中,有2只为禽REV抗原阳性。材料和方法一、被检鸡血清:随机取样,分别采自江苏省南京市、江都县和泰县3个鸡场的不     

防治奶牛乳房炎的基因工程新药

奶牛乳房炎是世界范围内发生最普遍、防治最难、花费最多的奶牛疾病之一，对奶牛业的危害主要是发生率高．奶产量降低和医药费用增加。目前奶牛乳房炎主要用抗生素防治，虽有一定的效果，但也日益暴露出耐药菌株和抗生素残留等危害人类健康的严重问题，特别是在我国，由于抗生素的长期、大量和盲目使用，治疗奶牛乳房炎无效的病例越来越多，从而给奶牛业造成了很大的经济损失。扬州大学江苏省转基因动物制药工程研究中心将基因治疗原理与溶菌酶的广谱抗菌作用相结合，研制出能取代抗生素防治奶牛乳房炎的基因工程新药，并已获得国家发明专利（专利号：ZL02148545．3），目前处于安全评价的中间阶段，现介绍如下。