流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。     

Rho A Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用

【目的】探究传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂（CCG-1423和Rhosin）、Rock 1抑制剂（Thiazovivin和Y-27632）及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂 Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。     

利用CRISPR/Cas9系统构建SBNO2基因敲除细胞系及其功能研究

【目的】草莓缺口同源物2(Strawberry Notch Homolog 2,SBNO2)是参与炎症反应的重要基因之一,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BHK-21细胞中SBNO2基因,初步探索SBNO2基因敲除后对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响.【方法】首先应用Western Blot方法检测FMDV感染的BHK-21细胞中SBNO2的表达情况.然后根据SBNO2基因设计三组sgRNA,分别插入pSpCas9-puro-2A载体,构建CRISPR/Cas9-SBNO2-sgRNA重组质粒,将重组质粒转染BHK-21细胞.通过扩增基因组SBNO2序列进行测序和Western Blot验证经嘌呤霉素筛选的细胞系中SBNO2基因的敲除情况.最终利用BHK-21-SBNO2基因敲除细胞系检测其对FMDV复制的影响.【结果】sgRNA成功插入pSpCas9-puro-2A载体,Western Blot验证敲除细胞系中SBNO2的蛋白表达下调;扩增SBNO2基因序列的测序结果表明在该基因编辑位点产生移码突变.敲除细胞系感染FMDV后,qRT-PCR结果显示FMDV结构蛋白VP1表达水平显著上调.【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功获得了BHK-21-SBNO2敲除细胞系,并发现SBNO2基因具有抑制FMDV复制的作用,为后续研究SBNO2基因作用于FMDV复制的分子机制奠定了基础.     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2 (MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pc DNA 3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pc DNA3. 1-Flag-MBD2,用pc DNA3. 1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRTPCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。     

密码子优化的甲型H1N1流感病毒HA/HA1基因真核载体的构建及初步表达

【目的】构建甲型流感病毒H1N1血凝素基因HA/HA1的真核表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。【方法】按照人的偏爱密码子,对H1N1流感病毒的HA/HA1基因进行优化改造,以提高其表达量,经全基因合成后插入到真核表达载体pSNAV中,构建了真核表达质粒pSNAV-Mod. HA与pSNAV-Mod. HA1;质粒转染BHK-21细胞,G418筛选后,用免疫荧光及Western blot技术检测其表达情况。【结果】成功构建了血凝素基因HA/HA1的真核表达载体。经G418筛选得到单克隆,免疫荧光技术和Western blot检测10代,显示Mod. HA和Mod. HA1皆可在BHK-21细胞中稳定表达。【结论】成功构建的流感病毒HA和HA1真核表达载体,可为今后开展多基因表达的基因工程疫苗及H1N1检测试剂奠定基础。     

PK-15细胞中与CSFV感染相关的microRNAs筛选及miR-214的功能研究

【目的】利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟(classical swine fever,CSF)的防控提供新依据。【方法】为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA。挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用。CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平。为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度。为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1相关的死亡区域蛋白(TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD),因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响。【结果】CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显。qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果。将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV, CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制。为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD。转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达。通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡。【结论】CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达。miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制。     

影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究

 【目的】流感病毒样颗粒在病毒学研究和新型疫苗开发方面发挥着巨大作用。本研究旨在建立一种简便的包装病毒样颗粒的方法来阐明影响流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白。【方法】构建同时表达HA、NA和M1 3个蛋白,同时表达HA和NA两个蛋白以及只表达HA蛋白的真核表达质粒,然后转染293 T细胞,检测细胞培养上清血凝效价初步判断是否包装并释放出病毒样颗粒,并采用透射电子显微镜观察病毒样颗粒的形态。【结果】表达HA和NA或表达HA、NA和M1蛋白的真核表达质粒转染293 T细胞后,检测细胞上清血凝价均为24 ;而转染单独表达HA蛋白质粒的细胞上清没有血凝活性。电镜观察表明单独表达HA蛋白没有可见的病毒样颗粒,而表达上述两个或3个蛋白均可观察到病毒样颗粒。【结论】本研究采用同时表达多个结构蛋白的真核表达载体来研究病毒样颗粒包装及释放的必须蛋白,研究结果表明M1在病毒样颗粒包装及释放过程中是非必须蛋白,而NA和HA蛋白是影响流感病毒样颗粒形成及释放的关键蛋白。     

白来航鸡IFITM1基因表达规律分析及其对鸡内源性反转录病毒转录的影响

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊, RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L~(-1) DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11, RT-qPCR检测处理后IFITM1的表达水平; PCR扩增IFITM1基因CDS区克隆、测序,进而构建pcDNA3.1-IFITM1真核表达载体;将过表达载体转染至CEF和HD11细胞, RT-qPCR检测IFITM1过表达对鸡内源性反转录病毒ALVE1、OVEX1和EAV-HP转录的影响。结果表明:IFITM1基因在胸腺、法氏囊等免疫器官中的表达量高于心、肝和脾等非免疫器官,且随着日龄的增长,在胸腺中的表达量上升,而在法氏囊中的表达量下降; DAC处理后,IFITM1表达极显著上调;测序发现IFITM1基因CDS区大小为342 bp;IFITM1过表达后,ALVE1、OVEX1在CEF和HD11细胞中转录均极显著下调,EAV-HP只在CEF细胞中极显著下调,而在HD11细胞中无显著变化。这一研究初步分析了鸡IFITM1基因的表达规律,构建了其真核表达载体,检测了其对鸡内源性反转录病毒转录的影响,为进一步研究其功能奠定了基础。     

PI3K/Akt信号转导通路在ALV-J感染中作用的初步研究

 【目的】探讨ALV-J在宿主细胞中复制与PI3K/Akt信号转导通路的关系。【方法】将血管瘤病变型ALV-J毒株HN06和骨髓瘤病变型ALV-J毒株NX0101分别感染DF-1细胞,通过Western blot、Real-time PCR、IFA和ELISA等方法,观察细胞Akt蛋白磷酸化水平、病毒RNA表达水平和病毒蛋白表达水平等指标。【结果】HN06株和NX0101株在体外细胞中复制水平有差异。HN06株的早期感染可引起Akt转导通路的活化,病毒引起的Akt磷酸化具有病毒滴度依赖性,而且能被PI3K特异性抑制剂LY294002所抑制,表明HN06株诱导的Akt活化是PI3K途径依赖的。LY294002可在病毒感染早期呈剂量依赖性地显著降低受染细胞中HN06 RNA水平、囊膜蛋白水平和细胞培养物上清中的病毒粒子含量。【结论】PI3K/Akt信号转导通路活化对HN06株在细胞感染早期具有重要的作用,该结果与已报道的有关细胞PI3K/Akt信号转导通路参与NX0101株的早期感染的结论一致。本研究为进一步阐明ALV-J入侵宿主细胞和复制的精确机制等研究奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】 对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物,构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID₅₀）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞,测定病毒的体外复制能力;将上述各株病毒以50 μL含10⁶EID₅₀的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠,分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器,匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况;将病毒分别以50 μL含10¹-10⁶EID₅₀的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠,感染后每天称量小鼠体重,当小鼠体重下降比率超过25% 时判定为死亡,统计死亡情况,测定病毒的小鼠半数致死量（MLD₅₀）,评估各突变病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒进行分析比较后,获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点,分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认,分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况,结果发现与亲本病毒rZD71相比较,突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后,复制滴度均显著提高;与rSY130相比较,突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后,复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒rZD71相比,225位氨基酸由G突变为E后,病毒rZD71-HA/G225E的MLD₅₀由4.32 log₁₀EID₅₀降低至3.0 log₁₀EID₅₀;病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到,而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】 HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用,提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况,为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

1998-2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律

【目的】 通过分析1998—2021年间我国人感染H9N2亚型禽流感病例的发病时间、所在省份、年龄和性别等信息,明确H9N2亚型禽流感病毒的流行病学特征;通过分析人源H9N2亚型禽流感病毒的基因特征,阐明人源H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律;为H9N2亚型禽流感病毒跨种间传播的预警和防控提供数据支撑。【方法】 基于流感基因数据库、病例报道和文献资料,获得1998—2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的病例信息和毒株序列数据。从时间、空间、性别和年龄的分布对感染病例进行分析,明确人源H9N2亚型禽流感病毒感染的流行病学特征。通过DNASTAR中的MegAlign软件对人源H9N2病毒的各基因片段的核苷酸序列进行同源性分析,利用MEGA7.0软件构建系统进化树和分析病毒蛋白关键位点,揭示遗传演化趋势和病毒蛋白关键氨基酸位点的变异情况。通过GISAID网站下载2019—2021年间我国H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列,利用mafft比对后在MEGA7.0中查看人源与禽源H9N2病毒关键氨基酸位点的突变差异,揭示当前人源和禽源H9N2病毒可能引起的风险。【结果】 1998—2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒病例共71例,从空间分布分析,病例分布于16个省市,其中91.55%的病例来自于南方12个省市;从时间分布分析,2013年以后,我国报道的感染病例呈增长趋势,2013—2021年累计感染病例数占总病例数的61.97%;从性别和年龄分布分析,男、女性别比为 1﹕1.68,感染病例主要见于幼儿和少儿,占总病例的74.14%。对人源H9N2病毒进行基因组比对分析,发现这些病毒均属于欧亚分支,但是这些病毒各基因片段的核苷酸序列同源性差异较大,HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS的同源性分别为75.3%—100%、80.1%—100%、78.7%—100%、82.5%—100%、72.6%—100%、74.1%—100%、65.5%—100%、82.0%—100%;22株具有完整基因片段的病毒分为8个基因型,2003、2008和2013年的基因型与1999年的基因型有明显差异。1998—2021年共有42株人源H9N2病毒株上传HA序列,其中有38株病毒的HA蛋白发生Q226L的突变;共有30株人源H9N2病毒株上传PB2序列,其中9株病毒的PB2蛋白发生E627V突变,1株病毒的PB2蛋白发生E627K突变;1株病毒的PB2蛋白的701位点发生D701N突变,共有31株人源H9N2病毒株上传 NS与M序列,NS1蛋白的42位点均为S,M1蛋白的30和215位点的氨基酸分别为D和A。2019-2021年人源H9N2病毒的HA蛋白183与190位点、NS1蛋白42位点均发生突变,人源与禽源H9N2病毒的PB2蛋白701位点均未发生突变。【结论】 自2013年以来,我国人感染H9N2亚型禽流感病例数量呈增长趋势,且具有显著的地域、年龄和性别差异。1998年至今,人源H9N2病毒的基因同源性差异较大,不同分支间病毒基因重排频繁,形成了复杂的基因型,提示H9N2亚型禽流感病毒在不断地进化。人源H9N2病毒的关键氨基酸位点出现突变,且在2019—2021年人源比禽源H9N2病毒的关键位点突变率高,提示H9N2亚型禽流感病毒的跨种感染人的潜力逐渐增强。该结果丰富了对人源H9N2病毒认知,为H9N2亚型禽流感病毒防控提供参考。     

不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

 【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制（HI）和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变（S→N）,导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点（S145）为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。     

陕西省avian-like H1N1猪流感病毒的遗传进化分析

【目的】监测陕西省猪流感的流行与传播情况,为猪流感研究提供参考。【方法】从生猪养殖场和屠宰场表观健康猪中随机采取猪鼻/气管拭子样本,经SPF鸡胚分离,对HA阳性样本进行猪流感病毒RT-PCR鉴定。测定分离株全基因序列,通过MEGA4构建基因进化树,并进行遗传变异分析。【结果】从500份样本中分离鉴定出6株H1N1流感病毒,病毒分离率为1.2%。获得6个核苷酸相似性为98.3%—99.1%的分离株全基因序列。遗传进化分析表明6个分离株都位于avain-like H1N1猪流感病毒谱系,与中国江苏,辽宁,山东和香港等地H1N1猪流感病毒株同源性达97%—99%。6个分离株的8个基因片段均在蛋白受体结合位点、潜在糖基化位点等处发生核苷酸变异,这将会影响猪流感病毒的抗原特性、宿主适应性和致病力。【结论】首次从西北地区表观健康猪中分离到H1N1猪流感病毒,并获得6个分离株的全基因序列。遗传进化分析表明,6个分离株为avain-like H1N1猪流感病毒, 且多处氨基酸位点发生变异。     

一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用 MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013（SW/ZJ/245/13）为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主（猪和人）上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个（N27、N40、N212和N291）位于HAl区,2个（N498和N557）位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个（N50、N58、N63和N68）在链接区,其他3个（N88、N146和N235）在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】 类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。     

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10~(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL~(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10~(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10~(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10~(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL~(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。     

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】 表达欧亚类禽型（eurasian avian-like,EA）H1N1猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA）蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】 利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100 μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠（I组和II组）,间隔3周后进行加强免疫（二免）;同等数量的小鼠以相同方式注射100 μL无菌PBS作为非免疫对照组（III组和IV组）。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制（HI）试验和病毒中和（VN）试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠（I组和III组）用50 μL（10 ^6.0EID₅₀）的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组（II组和IV组）用A/swine/Heilongjiang/44/2009（H1N1）（HLJ44）病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3 天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。 【结果】 经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒pCAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。10 ^6.0EID₅₀的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;10 ^6.0EID₅₀的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低（P<0.0001、P <0.001、P <0.05）。 【结论】 重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒 pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。