利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。     

间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。     

DNA甲基化抑制剂DAC处理对鸡Wnt10a基因表达及其启动子甲基化的影响

Wnt10a基因在细胞增殖、分化及迁移中发挥着重要作用,参与调控机体生长发育的诸多生物学过程,但对鸡Wnt10a基因表达的表观遗传调控机制尚不清楚.为探究DNA甲基化对Wnt10a基因表达的影响,以DMSO处理为对照组,5-Aza-2'-deoxycytidine (DAC)处理为试验组,分别用0.25、0.5、1.0、2.5、5.0tμmol·L-1浓度的DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1,通过RT-qPCR分析比较Wnt 10a基因在DAC和DMSO处理后的表达水平;同时通过NCBI数据获取Wnt10a启动子区序列,设计亚硫酸氢盐测序(BSP)引物,5.0 μmol·L-1 DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1 48 h,焦磷酸测序分析鸡Wnt10a基因上游部分CpG位点的甲基化水平.结果 表明:相对于DMSO处理,DAC处理Wnt10a基因表达量极显著上调,且上调幅度随DAC处理浓度的升高而升高;同时Wnt 10a基因上游CpG位点甲基化水平显著下降.综合而言,DNA甲基化抑制剂DAC可显著降低鸡Wnt 10a基因起始位点上游序列部分CpG位点的甲基化水平,并激活Wnt10a基因的表达.     

白来航鸡IFITM1基因表达规律分析及其对鸡内源性反转录病毒转录的影响

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊, RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L~(-1) DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11, RT-qPCR检测处理后IFITM1的表达水平; PCR扩增IFITM1基因CDS区克隆、测序,进而构建pcDNA3.1-IFITM1真核表达载体;将过表达载体转染至CEF和HD11细胞, RT-qPCR检测IFITM1过表达对鸡内源性反转录病毒ALVE1、OVEX1和EAV-HP转录的影响。结果表明:IFITM1基因在胸腺、法氏囊等免疫器官中的表达量高于心、肝和脾等非免疫器官,且随着日龄的增长,在胸腺中的表达量上升,而在法氏囊中的表达量下降; DAC处理后,IFITM1表达极显著上调;测序发现IFITM1基因CDS区大小为342 bp;IFITM1过表达后,ALVE1、OVEX1在CEF和HD11细胞中转录均极显著下调,EAV-HP只在CEF细胞中极显著下调,而在HD11细胞中无显著变化。这一研究初步分析了鸡IFITM1基因的表达规律,构建了其真核表达载体,检测了其对鸡内源性反转录病毒转录的影响,为进一步研究其功能奠定了基础。     

二甲双胍对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达影响及其抗禽白血病病毒能力分析

本研究旨在探讨二甲双胍(metformin)处理对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达及禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV)复制水平的影响。用2mmol/L二甲双胍处理鸡巨噬细胞HD11,处理48h后收集细胞,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测天然免疫基因和内源性反转录病毒的表达。另外,将J亚群禽白血病病毒(J subgroup Avian leukosis virus,ALV-J)(MOI=5)接种于细胞板中,病毒感染细胞24 h后进行二甲双胍处理, 48 h后收集HD11细胞和上清分别进行RT-qPCR检测和ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测。结果表明,二甲双胍显著上调HD11细胞天然免疫相关基因TLR3(P<0.01)、IFIH1(P<0.01)、IRF7(P<0.01)、STAT1(P<0.05)、IFN-α(P<0.01)、IFN-β(P<0.01)表达水平,并激活了鸡内源性反转录病毒的表达,抑制ALV-J复制水平。综上,二甲双胍可激活鸡巨噬细胞的天然免疫反应,从而提高鸡抗禽白血病病毒的能力。本研究在体外实验中验证二甲双胍具有抑制ALV增殖的作用,对家禽业的疾病防控有一定的应用价值。     

鸡β2-微球蛋白的基因克隆与原核表达

本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m 基因全长片段，然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（＋），转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG对其进行诱导表达，利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示，采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp，编码120个氨基酸，与基因库公布的相一致，同源性为100%；经0.8 mM IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清；利用His标签纯化该蛋白， SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带；Western-blot分析表明，纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实，本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白，为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。     

鸡c-myc原癌基因反义RNA的鉴定及其抗ALV-J能力的分析

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制.为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术、PCR扩增5'-race和3'-race后对其编码属...     

荧光定量PCR检测Meq基因在马立克氏病病毒感染过程中的动力学变化

为探讨马立克氏病病毒强、弱毒株致癌基因Meq在感染过程中的变化规律,本研究用超强毒株RB1B与疫苗株CV1988分别感染次代鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fiber cell,CEF）,用荧光定量PCR方法检测Meq的变化规律。结果发现,疫苗株CV1988的Meq在感染细胞内持续上调,而超强毒株RB1B的Meq在感染细胞内72h前为逐渐上调,然后下调;动物感染试验结果发现,超强毒株RB1B的Meq在鸡胸腺和脾脏组织内均表现为感染d21出现一个表达高峰,而疫苗株CV1988的Meq在SPF鸡胸腺q-d14出现高峰,然后下降。有趣的是CV1988的Meq在脾脏组织中d14表达最低,然后持续升高。本研究为进一步研究Meq在马立克氏病病毒感染过程中的致瘤机理提供重要资料。     

ALV-J下调鸡MARCO转录水平拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARCO过表达对ALV-J复制水平的影响,最后通过RT-qPCR检测MARCO过表达对巨噬细胞天然免疫相关基因TLR3和IFIH1转录水平的影响.结果 表明:ALV-J env蛋白对MARCO基因mRNA转录水平有极显著抑制作用;过表达MARCO极显著抑制ALV-J病毒的复制;过表达MARCO后,TLR3和IFIH1基因mRNA转录水平均极显著上调.这一研究揭示了MARCO基因在ALV-J感染巨噬细胞后的动态转录水平规律及其抑制ALV-J增殖的功能,其可能通过诱导天然免疫基因TLR3、IFIH1高转录水平的途径来实现抗病毒作用,为今后研究MARCO的功能及治疗禽白血病提供了新的思路.