鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究

对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) HQ株在DF-1细胞上的适应及增殖条件进行了研究,结果表明,HQ株不适应在Vero细胞上生长,而在DF-1细胞上能够很好的适应.经培养条件优化,最终选用pH值为7.0,血清含量体积分数为2％的DMEM/F12培养基做维持液,在细胞传代后第2天接种IBDV HQ株,接毒量为1％(约0.7...     

IBV抗体的银加强金标免疫技术检测

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的银加强金标免疫技术（SECGA）；【方法】将胶体金标记纯化的兔抗鸡IgG，然后将IBV纯化抗原包被于NCM上（0.4ug/片），封闭后在膜片上滴加不同稀释度（10×2X）的血清，作用10分钟，洗涤后浸于1：4金标兔抗鸡IgG液中作用60分钟，再银染10分钟观察结果；【结果】SECGA能检出IB阳性血清的抗体＞10×27，而不与ND、EDS76、IBD阳性血清发生有意义的交叉反应（抗体滴度＜10×22）。对鸡IgG的最小检测量为0.88ng。用SECGA、气管环中和试验、ELISA试验检测IB抗体有明显的相关性；【结论】银加强金标免疫技术（SECGA）可用于IB抗体的检测,具有敏感、特异、简单、快速、适于现场诊断等优点，适宜于广大基层单位使用。     

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制

利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体（McAbs）进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。     

河南不同临床型鸡支气管炎病毒流行毒株的分离鉴定及其S1基因变异分析

经鸡胚接种、RT-PCR、气管环培养等方法从河南地区发病鸡群中分离、鉴定出2株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitic virus,IBV),分别命名为HN/HL株和HN/SG株。应用RT-PCR方法对尿囊液中HN/HL株和HN/SG株以及本室保存的H120株的S1基因全序列进行了扩增,并对其进行克隆测序。结果显示,3株IBV目的片段全长分别为1828、1825、1819bp,3个序列相互之间存在多位点的变异,同时存在插入和缺失现象;对推导的氨基酸序列进行分析表明,HN/HL株S蛋白裂解识别位点序列为HRRRR,而HN/SG株和H120株S蛋白裂解识别位点同为RRFRR。将测序结果同GenBank上登录的其他IBVS1基因相比较,发现本试验的HN/HL株与疫苗H120株的同源性仅为78.1%,HN/SG株与H120株的同源性仅为81.1%,而HN/HL株与HN/SG株的同源性为87.9%。同源性及遗传进化分析还发现,已报道的腺胃型ZJ971株和QX株在分子水平上应该分别属于呼吸型和肾型IBV。     

IB(M41株)种毒代次和免疫原性的关系

评估不同代次IBV M41株种毒是否可以作为生产用种子。将M41株种毒用SPF胚连传8代，从中选出第3、第5、第7代，测定其EID50。并用此3代M41株鸡胚尿囊液制毒的油乳苗免疫易感鸡，以HI试验检测其抗体水平。3种疫苗免疫鸡均保护9/10以上，对照鸡全发病；对免疫后与免疫前HI抗体水平的比较表明，免疫后抗体平均滴度提高3倍以上。不同代次的M41毒株的免疫原性仍然保持良好，可以正常用来制造疫苗和建立种子批。     

株)二联灭活苗的免疫保护期测定

 传染性支气管炎能引起鸡的急性、高度接触性的呼吸道、消化道和泌尿生殖道疾病，对我国养鸡业构成严重威胁。而新城疫也是危害我国养鸡业的重要传染病。疫苗免疫是公认的预防这2种疫病的方法。本研究利用自制的3批ND-IB二联灭活疫苗，分别对28日龄易感雏鸡和120日龄开产前母鸡进行免疫，利用HI试验测出试验鸡群的抗体值。结果表明28日龄易感雏鸡在2个月内，开产前母鸡在3个月内均受到有效保护，为本批新支二联疫苗的实际临床免疫接种提供了依据。      

单抗介导的银加强金标免疫技术检测传染性支气管炎病毒

利用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG,建立了一种银加强金标免疫技术(SECGA)检测IB抗原.检测抗原时先将抗原点样于硝酸纤维素膜(NCM)中央,封闭后浸于1:40 IBV单抗中作用10 min,洗涤后再浸于1:4金标羊抗鼠IgG液中作用1 h,银染10 min后观察,在膜上出现灰黑斑点的为阳性结果,反之,不出现斑点为阴性结果.SECGA对IB抗原最低检测量为0.703 ng/点(2 μL),对含毒尿囊液的最低检测量为102.9 EID50,检测IBV M41在鸡胚中繁殖时以36～54 h含毒量最高;检测SPF鸡气管粘液,至少于感染后3 d内检出病毒.结果表明,SECGA检测抗原可用于IBV早期诊断,具有群特异性、快速、敏感、简便,不需特殊设备、结果易判定等优点,尤适于基层实验室或现场应用.     

IBVNP基因的可溶性表达及间接ELISA方法的建立

利用RT-PCR技术将传染性支气管炎病毒M41株的N基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-NP.将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,NP基因获得高效表达.经SDS-PAGE与Western blotting检测证实表达的NP蛋白具有免疫学活性,且以可溶性蛋白形式存在.以此抗原建立了检测传染性支气管炎病毒抗体的酶联免疫吸附试验 (NP-ELISA)方法.敏感性测定证实,当阳性血清1∶500倍稀释时,D450值为0.356,说明仍能检测到IB抗体,该方法比较敏感.特异性试验显示该法与AIV H9、H5、IBD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;NP-ELISA和商品化试剂盒对75份血样的阳性检出率分别为57.33%和61.33%,符合率为85%.NP-ELISA与商品化的HI试剂检测结果没有明显相关性,其效价与攻毒保护也没有相关性.     

传染性支气管炎病毒NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达

[目的]生产具有生物活性的、可用于临床检测的NP融合蛋白抗原,建立可用于临床检测IB抗体诊断的试剂盒。[方法]利用RT-PCR技术扩增传染性支气管炎病毒M41株的NP基因,将之克隆并重组于原核表达载体pET-28a,经PCR、酶切鉴定及序列分析构建重组表达载体pET-NP,研究NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达。[结果]将重组载体pET-NP转化表达菌BL21,获得阳性重组菌pET-NP-BL。阳性重组子经IPTG诱导后,目的基因NP获得了高效表达。表达产物经过SDS-PAGE与Western blot检测表明,NP分子量约为49 kD,且以可溶性蛋白形式存在;表达产物可与特异性传染性支气管炎病毒抗血清发生免疫反应。表达产物可以用作检测IB抗体的抗原。[结论]该融合蛋白可用于生产检测IB的诊断试剂,生物安全性高,生产方便。但尚需建立适当的检测方法,进一步研究其实际诊断价值。同时也可以研制新型IB重组亚单位疫苗,进一步研究其刺激动物机体产生的细胞与体液免疫,深入研究新功能,筛选新的抗原表位,为生产新型IB基因工程疫苗奠定基础。     

传染性法氏囊病流行强毒株与J_4强毒株致病力的比较

用传染性法氏囊病(IBD)流行强毒株“郑毒”株与保存的强毒J_4株人工感染7日龄和45日龄IBD阴性鸡、非免疫鸡胚及鸡胚成纤维细胞。对7日龄雏鸡,“郑毒”株能引起75%发病,23%死亡;J_4株只造成亚临床感染。对45日龄雏,“郑毒”株经40～60小时能引起100%发病,45%死亡,且肌肉、肾、肠、腺胃、法氏囊严重出血,法氏囊萎缩迅速,接毒后3天和8天的囊/体重比值分别为1.7和0.58;J_4株虽也可引起发病,但症状轻微,10%死亡,接寿后3天法氏囊显著肿胀,囊/体重比值为3.9,是“郑毒”株的2.2倍。两毒株虽能在非免疫鸡胚上增殖,并致其死亡,但“郑毒”株引起的死亡率高于J_4株,且病变更严重。在鸡胚成纤维细胞上盲传3代,两毒株都不出现CPE,表明还不适应于细胞上增殖。对接毒后进行LaSota疫苗免疫的7日龄雏鸡,“郑毒”株能产生更大的免疫抑制。据两毒株在致病力上的差异表明,”郑毒”可能是一株毒力更强的血清Ⅰ型亚型株或变异株.