猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

福建省一株猪瘟病毒流行毒株全基因组序列测定与分析

根据GenBank公布的猪瘟病毒(CSFV)标准参考毒株全基因组序列,设计11对引物,应用RTPCR方法分别对11个片段进行福建流行毒株CN-FJLY的全基因组扩增,与参考毒株进行序列分析比较。结果表明,福建流行毒株CN-FJLY基因组全长为12 296bp,与参考毒株SXCDK、HEBZ、GXWZ02、HNLY-2011和Zj0801的全基因组核苷酸同源性为93.0%～97.0%,而与1.1亚群的中国强毒Shimen、疫苗株HCLV全基因组核苷酸同源性为84.4%～85.3%。基于全基因组及E2基因构建的遗传进化树分析结果表明福建流行毒株CN-FJLY属于2.1b亚群,与Shimen株、HCLV疫苗株亲缘关系较远。与HCLV相比较CN-FJLY基因组变异较大的是5′UTR、Ems、E2、p7、NS2、NS5A、NS5B和3′UTR。综上说明福建省猪瘟病毒流行毒株正在向远离疫苗株的方向变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。     

猪巨细胞病毒GX株gB基因的克隆与序列分析

从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒GX株,通过PCR扩增得到猪巨细胞病毒GX株gB基因的一个1736bp片段,扩增产物经克隆、测序,得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比,其同源性在97.8%～98.9%,与人巨细胞病毒分离株的同源性在32.0%～43.6%,表明gB基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中,GX株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而与人巨化细胞病毒差异较大。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1003株全基因序列测定与分析

为了解广西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采用RT-PCR对PRRSV广西地方分离株GX1003株全基因组进行分段扩增、测序与分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,GX1003株基因组全长为15 320nt。同源性分析表明,GX1003株与比对的国内外PRRSV美洲型毒株全基因核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%和82.1%～99.1%,与欧洲型代表株LV株的同源性分别为60.6%和51.3%。序列分析表明,GX1003株的NSP2编码区存在第481位aa和第533～561aa发生30个氨基酸的不连续缺失,具有高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的遗传特征;同时,在不同编码区出现与HP-PRRSV代表株JXA1株不同的遗传变异现象。遗传进化分析表明,比对的所有美洲型毒株可以分为4个亚群,GX1003株分布在以JXA1株为代表的亚群4中。表明PRRSV广西地方分离株GX1003株属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异。     

猪源和鼠源脑心肌炎病毒分离株基因组的比较分析

为了分析猪源和鼠源脑心肌炎病毒(EMCV)基因组的差异,对分离自同一猪场猪临床样本和鼠组织样本的2株病毒(GX0601和GX0602)进行了全基因组序列测定和比较分析.结果显示,2个分离毒株的基因组全长(包含poly A)分别为7 729和7 725 nt,核苷酸和氨基酸同源性均在99.8%以上.与国外毒株及国内已报道的分离株的序列比较结果表明,2个毒株与BJC3和HBl的核苷酸同源性为98.18%～99.41%,推导的氨基酸序列同源性为99.5%～99.7%,与国外分离株的核苷酸序列和氨基睃序列的同源性分别介于80.53%～99.57%和93.1%～99.5%.基于基因组开放阅读框推导的氨基酸序列的系统进化分析表明,我国分离毒株与国外毒株PEC9、CBNU、BEL-2887A/91和EMCV-R的同源性较高,位于同一个亚群.研究结果提示,猪源与鼠源毒株的基因组具有很高的同源性,鼠是猪场EMCV感染的传染来源.     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒云南毒株的分离鉴定及E2基因的原核表达

从云南10个地州15个大型猪场采集到的21份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99.99%同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99.99%同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×106TCD50/mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1 200 bp的E2蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E2基因片段为1173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性为82.5%和84.3%,与C-株的核苷酸同源性分别为83.3%和85.4%。将E2基因插入原核表达载体pET-41a(+),转化进BL21(DE3)内进行表达,经IPTG诱导,E2蛋白能在菌体内高效表达,表达量达26.5%,蛋白分子质量约为41kD。本研究为猪瘟诊断抗原及基因工程疫苗的研制打下基础。     

广西部分地区猪链球菌的分离鉴定及小鼠致病性研究

对来自广西边境地区部分发病猪场及屠宰场的370份猪组织进行细菌分离鉴定,共分离到16株链球菌,对这16株链球菌进行了形态学观察、PCR鉴定及小鼠致病性试验。结果表明,其形态、染色、生化特性均符合猪链球菌的特点,通过GDH鉴定与测序,证实这16株菌株均为猪链球菌,分别命名为GX1~GX16。通过特异性引物PCR分型（35个血清型）,其中有1株为1型,1株为2型,1株为5型,1株为29型,5株为8型,7株未分出型。用这16株猪链球菌对昆明小鼠和BALB/c小鼠进行动物致病性试验,结果发现,菌株GX10对昆明小鼠和BALB/c小鼠致死率均为100%;菌株GX11对BALB/c小鼠致死率为80%;其他菌株对昆明小鼠和BALB/c小鼠均无致病性。菌株GX10、GX11对BALB/c小鼠的LD₅₀分别为4.5×10⁵和3.6×10⁹ CFU。本试验结果表明,广西边境地区存在致病性猪链球菌8型。BALB/c小鼠对猪链球菌的敏感性高于昆明小鼠,更适合作为猪链球菌致病性研究的动物模型。     

牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型（bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1）广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945 bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株（M20219.1）、BPV-13型参考株（JQ798171.1）同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。     

Isolation,Identification and Pathogenicity on Mice of Streptococcus suis in Pig in Guangxi Border Area

16 strains of Streptococcus were isolated and identified from 370 pig tissues of clinically morbidity farms and slaughter houses in Guangxi border area.Morphological observation, PCR identification and pathogenicity test were carried out. The results showed that the morphology,dyeing,biochemical characteristics were coincidence with the characteristics of Streptococcus suis,confirmed that 16 strains were Streptococcus suis,and named as GX1 to GX16. Further by divided type identification (35 serotypes) by GDH,1 strains was type 1,1 strains was type 2,1 strains was type 5,1 strain was type 29,5 strains were type 8 and 7 strains could not differentiate types. The pathogenicity of 16 strains Streptococcus suis were detected by Kunming mice and BALB/c mice. The results showed that the letal rate of GX10 for Kunming mice and BALB/c mice was 100%;GX11 for BALB/c mice was 80%;Other strains were apathogenicity to the Kunming mice and BALB/c mice. The LD₅₀ of GX10 and GX11 was 4.5×10⁵ and 3.6×10⁹ CFU for BALB/c mice,respectively. The results showed that pathogenic Streptococcus suis type 8 occured in Guangxi border area. The sensitivity of BALB/c mice to Streptococcus suis was higher than Kunming mice, BALB/c mice was more suitable for the pathogenic study of Streptococcus suis.     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

2018年中国部分地区猪瘟病毒2.1d亚型新流行株的基因组特征分析

为了解中国猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的分子流行病学及遗传变异情况，本研究应用RT-PCR方法对2018年采集自河南、河北、山东、黑龙江和辽宁5个省份的350份疑似CSFV感染的病料进行E2和NS5B基因扩增，并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示，350份样品中21份为CSFV阳性，共获得14株CSFV的E2基因序列和7株CSFV的部分NS5B基因序列。E2全基因、NS5B部分基因序列分析表明，21份阳性样品均属于近年来在中国流行的CSFV 2.1d亚型，且新发现的2.1d亚型CSFV与中国较早2.1d亚型CSFV毒株间同源性差异不大，新发现的2.1d亚型CSFV分离株在E2基因的6个氨基酸（R³¹、S³⁴、W¹⁸²、K²⁰⁵、K³⁰³、A³³¹）上具有相同的分子特征，E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异。韩国2.1d亚型CSFV在E2蛋白上具有3个独特的氨基酸（N⁹⁷、K¹⁵⁹、R²⁰⁵）特征，并且发现了韩国毒株YC11WB可能作为2.1b和2.1d亚型CSFV过渡毒株的证据，流行于中国和韩国的2.1d亚型CSFV可能分别来自于本国早期2.1b亚型CSFV的衍化。本研究证实，2018年中国及周边国家CSFV较为活跃，且流行毒株依然以2.1d亚型为主，为中国科学防控CSFV提供了依据。     

Prevention of transplacental transmission of moderate-virulent classical swine fever virus after single or double vaccination with an E2 subunit vaccine

The use of a vaccine against classical swine fever virus (CSFV) during an outbreak of CSF should lead to a reduction in the horizontal or vertical transmission of CSFV. The reduction of vertical, i.e. transplacental, transmission of a moderate-virulent strain of CSFV from the sow to its offspring was studied in sows vaccinated once or twice with a CSFV E2 subunit vaccine. Two groups of nine sows were vaccinated with one PD95 dose of the E2 subunit vaccine, approximately four weeks before insemination. A third group of nine inseminated sows served as controls. One group of nine sows were vaccinated again at two weeks after insemination. At ten weeks after the primary vaccination, approximately six weeks after insemination, all 27 sows were challenged intranasally with 10(5) TCID50 of a moderate-virulent strain of CSFV, the Van Zoelen strain. The sows were euthanized at five weeks after challenge, and samples from the sows and fetuses were collected for detection of CSFV. All 27 sows were in gestation at the time of slaughter, CSFV was detected in the fetuses of all unvaccinated sows but it was not detected in any of the samples collected from fetuses of the double-vaccinated sows. Virus was however recovered from the fetuses of one out of nine sows vaccinated once. All the sows, except four double-vaccinated sows, developed CSFV Erns antibodies. Transplacental transmission of CSFV was reduced significantly (p <0.001) in all vaccinated sows. When the results from the experiment were extrapolated to a herd level, it could be concluded that, with 95% certainty, approximately 11% (single vaccination) or 0% (double vaccination), confidence intervals of 0.01-0.44 and 0.0-0.30 respectively, of the pregnant sows would still not be protected against vertical transmission of moderate-virulent CSFV. We conclude that vaccination with the CSFV E2 subunit vaccine can reduce the transmission of moderate-virulent strain of CSFV from the sow to its offspring significantly.