传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

放养鸡感染传染性法氏囊病病毒继发细菌感染而致关节炎的诊断

2017年12月,桂林某养殖公司放养的广西龙胜凤鸡连续多批次出现单侧或者双侧跛行、站立不稳、食欲减退、羽毛蓬乱等症状,共造成鸡群20%的发病率和1%~2%的死亡率。剖检发现病变主要发生在鸡跗关节以下,从跗关节沿肌腱向下剪开,可见淡黄色清亮液体流出,法氏囊萎缩。无菌取鸡的病变关节处液体及其组织分别进行细菌和支原体的分离培养,并用其法氏囊组织研磨液进行传染性法氏囊病病毒的RT-PCR检测。结果分离到大肠杆菌和葡萄球菌,支原体分离检测呈阴性,传染性法氏囊病病毒检测呈阳性。根据鸡群发病情况、临床症状、剖检病变和实验室病原检测结果确诊该鸡群为传染性法氏囊病病毒感染后引起机体免疫抑制而继发的细菌性关节炎。     

乌鸡一株A亚群禽白血病病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了解广西地区某乌鸡养殖场中是否存在禽白血病病毒(ALV)感染,将从该养殖场中无菌采集的抗凝血分离的血浆接种DF-1细胞进行病毒分离,并采用ELISA和PCR扩增的方法对细胞培养物分别进行检测,成功分离鉴定出一株A亚群禽白血病病毒(ALV-A),命名为GX18LZA01株。测序结果显示GX18LZA01株前病毒基因组DNA序列全长7 561bp。遗传演化分析显示,GX18LZA01与10株国内外A亚群参考毒株同处一个大的分支,核苷酸(nt)相似性为91. 8%~96. 6%,其中与SDAU09C1参考株相似性最高(96. 6%);进一步对其gp85基因的分析发现,它与A亚群参考毒株也同处一个大的分支(nt:87. 9%~97. 8%),与全基因组分析的结果一致。本研究结果表明,乌鸡存在A亚群ALV感染,gp85基因可以替代全基因组作为其分子流行病学和系统发育研究的最佳选择。     

广西地方优质鸡禽白血病与鸡白痢净化检测的关系

禽白血病(avian leukosis,AL)是由反转录病毒科的禽白血病病毒(avianleukosis virus,ALV)引起的禽类肿瘤性疾病之一。近年来,AL在我国的地方品系的鸡群中广泛流行[1],发病率呈逐渐上升趋势,给养鸡场带来了巨大的经济损失;鸡白痢(plorum disease PD)是由鸡白痢沙门菌所引起的一种常见的传染病[2],是严重危害我国养鸡业发展的传染病[3-4]。研究表明,母鸡感染了鸡白痢沙门氏菌后,会严重影响种蛋的孵化率及雏鸡的成活率[5],对此病的防治应引起高度重视。     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

雏番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒混合感染的检测

2017年12月,广西某番鸭养殖场的鸭群出现生长缓慢,临床表现软脚,拉白色粪便的腹泻并伴有一定的神经症状等;剖检可见肝脏肿大出血、腹腔有纤维素性渗出物、肠黏膜有不同程度的充血,法氏囊萎缩等病变;于20日龄开始发病,30日龄送检时发病率20%、死亡率10%。无菌取番鸭的病变组织,分别进行番鸭细小病毒(MDPV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的核酸特异性检测,结果均呈阳性,并成功分离到一株番鸭细小病毒(命名为MDPV GX1712)和一株传染性法氏囊病病毒(命名为GL1712);基因序列分析结果显示,分离株GX1712与GX5、P 1988、 SAASSHNH等MDPV参考株的亲缘性最近,相似性高达98.5%～99.1%,在进化树中处同一个分支,并且与疫苗株FZ91-30亲缘性相距较远,表明该分离株为MDPV野毒株;基于VP1-b序列分析IBDV分离株GL1712与中国新型超强毒株HLJ0504同属HLJ0504-like cluster,而基于vVP2序列则与中等偏强毒力参考株同属C2-intermediate IBDV genotype,为基因重排毒株。根据发病日龄、临床症状、病理剖检和实验室诊断,确诊该临床发病番鸭群混合感染了番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒。     

ALV与MDV混合感染造成鸡群临床肿瘤暴发的诊断

2017年11月,广西某公司两个商品鸡群出现鸡只食欲不振、排绿色粪便症状。病鸡解剖发现内脏有肿瘤发生,采集肿瘤组织和外周血淋巴细胞分别进行病理组织学观察、病毒分离以及PCR鉴定,结果显示两批鸡均为J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus sub-group J,ALV-J)与马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)的混合感染。从每群发病鸡分别获得的2株ALV-J和2株MDV的基因序列测定与遗传进化树分析结果显示,4株ALV-Jgp85基因相似性为100%,均与广西分离株GX15MM6-2的亲缘关系最近,而与NX0101的距离相对较远。4株MDV之间meq基因相似性为99.0%~99.9%,其中1株与MDV标准强毒GA在同一个分支,另外3株与广西分离的MDV超强毒GXY2、GX0101距离最近且在同一个分支,都具有MDV-1型强毒株的特征。