传染性支气管炎病毒DS10株S基因分析及其杆状病毒表达产物免疫原性鉴定

对肾型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ck/Jiangsu/DS10/2008株(DS10株)S基因进行扩增、克隆和序列测定,并与GenBank中的其他25株参考株构建进化树进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9昆虫细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。S基因序列分析表明,S基因高变区域主要集中在157～230位、349～433位、787～886位之间,裂解位点序列为SHRRRRμSI。遗传进化分析表明,DS10与Vic株处于同一分支,而与H120等常用疫苗株相距较远。经间接免疫荧光检测表明,S蛋白在Sf9细胞中得到表达,琼扩试验验证表达产物具有良好的反应性,表明所表达的S蛋白具有良好的生物学活性。本研究表达的S蛋白可为传染性支气管炎诊断抗原的研制、新型疫苗的开发等提供基础材料。     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白真核表达载体的构建及其产物抗原性的鉴定

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)GX-YL5毒株为模板,PCR扩增其E基因并克隆至融合有His标签的杆状病毒转移载体pFastBac~(TM)/HBM-TOPO,构建重组转移载体pFastBac~(TM)/HBM-TOPO-E,转化DH10Bac~(TM)感受态,经同源重组后转染Sf9细胞,并应用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot进行鉴定。IFA结果表明融合了E蛋白的表达产物可被抗His标签的鼠单克隆抗体识别,在感染的细胞膜表面呈现强的黄绿色荧光;Western blot结果显示融合了E蛋白的表达产物既可被抗His标签的鼠单克隆抗体识别,也可被GX-YL5株的多抗血清特异性识别,且二者的目的条带大小均为16 ku。说明本研究已成功在Sf9细胞中表达了E蛋白,且表达产物抗原性良好,为进一步探讨IBV E蛋白的生物学功能和构建病毒样颗粒提供了基础。     

克隆和表达传染性支气管炎S蛋白复合抗原表位作为制备单克隆抗体的免疫原

作为传染性支气管炎病毒的一个免疫原,纤突蛋白(S蛋白)是一个很有潜力的作为制备单克隆抗体的免疫原蛋白.本研究利用特异性引物从传染性支气管炎病毒M41株克隆出S基因保守性好的一段抗原表位区域(简称Sf),利用大肠杆菌原核表达系统表达出Sf,并把纯化好的Sf作为免疫原免疫6周龄Balb/C鼠.结果表明,该重组蛋白能有效地刺激小鼠产生高滴度的抗体,因此Sf非常适合作为单克隆抗体的免疫原蛋白.     

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础.     

猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达

以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。     

广西优势血清西优势血清型IBV代表株M基因在杆状病毒系统中的表达

采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac~(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。     

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因.将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过问接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在SD细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性.     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

传染性支气管炎病毒TY1株结构蛋白基因部分片段的表达

根据已报道的传染性支气管炎病毒S基因序列设计了1对引物，利用从传染性支气管炎病毒TY1株中提取的RNA，经PCR扩增获得了300bp的产物；序列测定与分析表明，所扩增产物是传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的部分片段。将扩增片段插入pET32a构建表达载体，并于大肠埃希氏菌BL21中进行表达；结果表明，该片段在大肠埃希氏菌中成功表达，产物为30ku、以可溶性形式存在的蛋白。Western—blotting分析表明，该蛋白可与传染性支气管炎病毒TY1株阳性血清发生反应。     

赤羽病毒G1基因的真核表达及抗原性检测

通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

将含有鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因的重组转座载体PFF转染昆虫细胞sf9,28℃培养,待细胞出现明显病变后,收取细胞,反复冻融,接种sf9昆虫细胞,如此再传代1次,收集细胞保留毒种,同时做表达产物的检测,结果表明,表达产物约占细胞总蛋白的10%,并有良好的反应原性。     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( )中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu,Westernblotting检测表明也有与结核分支杆菌抗血清特异反应的蛋白条带     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。