人内皮抑素在家蚕细胞和幼虫中的表达

将人内皮抑素（Endostatin）基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，获得重组转移载体pBacPAK-Endo，并与修饰性线性化病毒Bm-BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞，二者在细胞内发生内源重组，经蓝白斑筛选及DNA点杂交，鉴定出含有Endostatin基因的重组病毒BmBac-Endo。将重组病毒感染家蚕培养细胞和五龄幼虫，经SDS－PAGE电泳、Western blotting分析及对人血管内皮细胞株ECV304的抑制活性测定，证明Endostatin在家蚕细胞和幼虫中得到高效表达，且表达产物具有良好的生物学活性。     

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。     

家蚕Bm30Kc6蛋白对过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡的抑制作用

30K蛋白是一类家蚕(Bombyx mori)血淋巴中具有最强抗细胞凋亡活性的蛋白,家蚕Bm30Kc6蛋白作为30K蛋白家族的成员之一,也具有较强的抗细胞凋亡作用,但其抗细胞凋亡的作用机制还不十分清楚。本研究将本实验室成功构建的重组病毒Bacmid-Bm30Kc6接种家蚕BmN细胞大量表达后,利用Ni-NTA蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白Bm30Kc6。SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示纯化蛋白的纯度较高。然后利用不同浓度(0.1、1、5和10mmol/L)的H2O2处理家蚕BmN细胞,诱导细胞发生凋亡,结果表明,在培养基中加入终浓度为5mmol/LH2O2孵育4h后即可成功诱导BmN细胞凋亡。在上述建立的H2O2诱导的家蚕BmN细胞凋亡体外损伤模型的基础上,分析了Bm30Kc6蛋白的抗细胞凋亡的活性及作用机制。首先利用CelldeathDetection ELISA试剂盒检测了细胞内的DNA片段化程度,检测结果表明,Bm30Kc6蛋白(终浓度5μg/mL)可明显降低H2O2诱导的家蚕BmN细胞内的DNA片段化程度。然后利用Cellproliferation ELISA试剂盒检测了细胞的增殖情况,结果表明,Bm30Kc6蛋白可以显著增强家蚕BmN细胞的活力。进一步利用8-isoprostane EIA试剂盒检测细胞内氧化应激标志物8-isoprostane的浓度变化,结果显示,家蚕Bm30Kc6蛋白可以显著降低胞内8-isoprostane的浓度。此外,Western blot分析结果显示,Bm30Kc6蛋白可显著抑制家蚕BmN细胞中细胞色素c从线粒体中释放进入细胞质。Bm30Kc6蛋白一方面可以通过降低BmN细胞内的氧化应激水平从而起到抑制细胞凋亡的作用;另一方面,Bm30Kc6蛋白也可以通过阻断H2O2诱导激活的线粒体通路来抑制细胞发生凋亡。本研究将为进一步深入研究家蚕Bm30Kc6蛋白的抗凋亡机制提供基础资料。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

生物素—亲和素系统在家蚕病毒研究中的应用:——Ⅰ家蚕DNV酶标组化法检测技术的研究

<正> 生物素一亲和素系统(Avidin-BiotinSystem)是一种被广泛用于免疫化学领域的新检测方法。具有特异性强、亲和力大和灵敏度高等优点。我们应用许世明1981年报道的ABC 法,对家蚕DNV 感染后的中肠进行酶标组化法检测。现将结果报告如下。材料和方法一、蚕品种:分别用易感品种丰_1×54A 的二龄起蚕、三龄起蚕和四龄起蚕。经口添食家蚕DNV。添食的病毒用钱元骏等     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316 871     

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的原核表达、纯化及活性检测

为进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的功能和作用机理,利用RT-PCR技术,从家蚕总RNA中扩增到家蚕SCI-SB基因片段,构建了含有GST标签的融合表达质粒pGEX4T-1-SCI-SB。采用pGEX融合蛋白表达系统,在大肠杆菌BL21中得到以包涵体形式存在的重组GST融合蛋白质,表达量可占菌体蛋白的15%。将包涵体变性、复性处理以后,进一步利用GSTTrapFF亲合层析一步获得了重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰纯种大白兔,获得效价高的多克隆抗体。胰凝乳蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组蛋白具有一定的酶活抑制作用。     

家蚕ycaCR基因的表达特征及蛋白质的亚细胞定位

ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。