密码子优化型鸭甲肝病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

为了提高基因A型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）VP1基因在昆虫细胞中的表达水平,本研究根据昆虫细胞密码子偏爱性对野生型DHAV VP1（wtVP1）基因进行改造,合成了optiVP1基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建了重组杆状病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1,分别转染对数生长期的sf9昆虫细胞表达VP1蛋白。转染72 h后,sf9细胞出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）, Western-blot和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果表明VP1蛋白在重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得了良好表达。用Image J软件对Western-blot扫描的图片进行灰度分析发现, optiVP1基因在昆虫细胞中的表达水平明显高于wtVP1。本研究为进一步研制诊断抗原和新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

禽流感病毒NS1蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得表达NS1基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒转染昆虫细胞sf9进行NS1蛋白的表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot、间接免疫荧光(IFA)对表达的目标蛋白进行分析。结果表明,构建了含NS1基因的重组杆状病毒,分子质量约30ku的重组蛋白得到了表达,为NS1的相关功能研究奠定了基础。     

禽流感病毒神经氨酸酶基因在重组杆状病毒中的表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计并合成引物。从H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高保真DNA聚合酶扩增NA基因,构建转移载体pFastBacHTA-NA,并与大肠杆菌DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-NA。在脂质体介导下将rBacmid-NA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达NA蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和激光共聚焦检测蛋白。结果表明:表达的NA蛋白分子量约为53 ku,该蛋白能与H5N1亚型AIV血清发生特异性反应,证明NA蛋白表达正确,具有良好的免疫反应性。     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

禽流感病毒GD／1／96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体pFastBacl质粒，PCR鉴定后，转化DH10BAC感受态细胞。提取重组秆粒rBacM,以M13为通用引物作PCR分析，证明M基因已转入其中。用Cell Fectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞，96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS－PAGE蛋白电泳和Western blot分析，证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明，重组M1蛋白可作为诊断抗原。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

O型FMDV VP1基因的真核表达及其产物的生物学活性

根据已克隆的O型口蹄疫病毒VP1基因序列，设计了1对带有Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物，用其将pMD18-T-VP1质粒中的VP1基因亚克隆到真核表达栽体pBlueBacHis2A中，成功地构建了重组表达质粒pBlueBacHis2A—VP1（633bp）。将pBIueBacHis2A—VP1（633bp）质粒与Bac-N—Blue^TM DNA共转染sf9昆虫细胞，蚀班筛选重组病毒后，将纯化的重组病毒感染sf9细胞，获得了32．6ku的目的蛋白条带。Dot—ELISA分析结果表明，该表达产物具有反应活性，可用于建立间接ELISA方法，进行口蹄疫病毒抗体检测。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。     

狂犬病病毒糖蛋白在Bac-to-bac杆状病毒系统中的表达及应用

为表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通过RT-PCR方法克隆RV Flury LEP病毒株G基因,将其克隆至质粒pFastBacHTα中,重组质粒pFastBac-RV-G转化DH10Bac感受态细胞,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV-G,将其转染昆虫细胞sf21获得含有G基因的重组杆状病毒.采用SDS-PAGE和western blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析,以重组G蛋白作为包被抗原的ELISA检测36份犬血清样品.结果表明,在Bac-to-bac杆状病毒系统中表达的RV G蛋白能与his-tag单克隆抗体及RV阳性血清发生特异性反应,其相对分子量为60 ku;与以RV为包被抗原的商品化ELISA试剂盒相比,以重组RV G蛋白为抗原建立的间接ELISA的敏感性、特异性和符合率分别为80%、81.8%和80.6%,表明杆状病毒系统表达的RV G蛋白是检测RV抗体的理想抗原蛋白,作为一种亚单位疫苗具有潜在的应用前景.     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.     

猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达

以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。