CDV强毒BJ16B2株H基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

试验旨在获得具有天然构象且抗原性良好的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)强毒株的H蛋白。以分离的CDV强毒株BJ16B2为模板,RT-PCR特异扩增H基因,克隆至表达载体pFastBacTMHTA上,酶切及测序鉴定正确后比对分析H基因同源性,并将重组质粒pFastBacTMHTA-H转化大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞,同源重组构建穿梭质粒rBacmid-H,将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,拯救重组杆状病毒。利用IFA和Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。结果显示,重组质粒pFastBacTMHTA-H酶切测序鉴定正确,该H基因属于Asia-1强毒株,与参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.3%和89.6%~99.5%。在杆状病毒中所表达的H蛋白能与CDV阳性血清及His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定能够产生特异性绿色荧光,且在68ku左右出现蛋白条带,表明H蛋白成功表达且具有良好的反应原性。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白,为后续蛋白结构和抗原特性差异分析、单抗制备、CDV亚单位疫苗的开发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒感染后猪外周血淋巴细胞Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA分析

【目的】丰富非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染后猪外周血淋巴细胞长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）表达谱,并进一步挖掘影响Toll样受体信号通路的调控网络。【方法】试验动物感染ASFV,于第7天采集外周血并分离得到外周血淋巴细胞,运用Illumina高通量组学测序对外周血淋巴细胞中lncRNA进行测序,原始数据经处理后筛选获得差异表达的lncRNA,并进行靶基因预测,利用生物信息学方法对靶基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,初步绘制与Toll样受体信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络,并对lncRNA-ENSSSCG00000041959在内的4个lncRNAs进行实时荧光定量RT-PCR验证。【结果】共筛选到73个差异表达的lncRNAs,其中上调表达lncRNAs 38个,下调表达lncRNAs 35个。GO功能分析结果显示,靶基因显著富集在调节免疫系统过程、防御反应、生物刺激、病毒反应和先天性免疫;KEGG信号通路富集分析显示,大部分靶基因与细胞循环、疾病及免疫应答有关,其中免疫相关信号通路有Toll样受体信号通路、TNF信号通路、产生IgA的肠道免疫网络等。进一步挖掘出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的重要调控网络,实时荧光定量RT-PCR与测序结果一致。【结论】本研究初步鉴定出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,为进一步探索lncRNA调控ASFV感染机体免疫反应奠定了理论基础。     

羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达.以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化.SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性.间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s.经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑.分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好.作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.     

牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价

为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。     

日光温室土壤温度变化特征和预报模型研究

[目的]研究日光温室内土壤温度变化规律及其预报模型。[方法]利用徐州地区标准日光温室内外气温和温室内多层次土壤温度观测资料,分析了温室内各层土壤温度的年变化和日变化,并对温室内土壤温度的预报模型进行了模拟和检验。[结果]温室内土壤温度年变化和日变化均呈单峰曲线,下层温度变化振幅小于上层。温室内各层土壤温度（最高值、最低值和平均值）与当日温室外同类型气温的相关性最为密切。以当日和前一日温室外日平均气温、日最高气温、日最低气温为预报因子,建立了温室内同类型不同层次土壤温度预报模型。温室内各层日平均温度的模拟效果优于对应层的最高温度的模拟效果,劣于对应层日最低温度的模拟效果;下层土壤日最高温度和日平均温度的模拟效果优于上层;实测土壤温度在15～30℃模拟效果较好,其他温度段模拟值较实测值偏低。[结论]该研究为日光温室内植物的生长发育环境提供理论依据。     

不同生育期水稻气孔阻力日变化规律研究

[目的]为掌握水稻叶片气孔阻力的变化规律提供理论依据。[方法]在晴天时,根据不同生育期内籼稻（宁粳一号）和粳稻（两优培九）叶片气孔阻力的日变化试验数据,分析了水稻冠层气孔阻力在不同生育期的日变化规律,探讨了品种间气孔阻力的差异和土壤水分胁迫对冠层气孔阻力的影响。[结果]在同一生育期内,籼稻（宁粳一号）和粳稻（两优培九）气孔阻力的日变化规律基本相似,在9：00～15：00变化平衡,15：00以后急剧增大;拔节期以前,9：00～15：00较小,生育期后期9：00～15：00明显增大。通过比较不同品种水稻气孔阻力可知,粳稻（宁粳一号）的气孔阻力明显高于籼稻（两优培九）,在生育后期差异明显。土壤水分对气孔阻力有较大影响,土壤水分含量的增加可以有效提高气孔开度,降低气孔叶片阻力;水稻植株叶片气孔阻力从上层到下层全天呈增大趋势。[结论]水稻叶片气孔阻力的大小与多种因素有关,包括不同生育期、品种、土壤水分、叶片冠层。     

猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。     

关于节能建筑围护结构保温层厚度的思考

在对建筑围护结构保温层厚度进行经济分析的过程中,考虑了环境保护因素,即参与清洁发展机制(CDM)项目合作,得出了一个简单的保温层经济厚度计算公式,并对大连地区典型建筑住宅围护结构保温层经济厚度进行了计算、分析、对比.结果分析表明:参与CDM的项目合作,不但可以使节能建筑的总投资费用大幅度降低,同时还使保温指标也产生了质的飞跃,这对我国建筑节能发展有积极的意义.该方法对我国某些具体的节能建筑的工程设计具有参考和应用价值.     

黑土区大豆重迎茬栽培与产量的关系及农艺对策

黑土区大豆重迎茬栽培与产量的关系及农艺对策黑龙江省绥化市农业技术推广中心１５２０６２郝天旭贾红孙文玉绥化市位于松嫩平原东部小兴安岭余脉的西部边缘。土壤大部分为黑土，黑土面积占全市耕地总面积的７０％。随着大豆价格的不断上涨，种植面积不断扩大，重迎茬问...     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。