IP-10作为牛结核病诊断标志物的初步探究

为评价细胞因子IL-12 p40、IP-10和TNF-α转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。采集田间筛选的结核病阳性牛、结核病阴性牛以及牛分枝杆菌68002人工感染牛的外周血淋巴细胞,经牛结核菌素(PPDB)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、MPT63、PET和PBS分别刺激6 h,提取细胞总RNA,用荧光定量PCR检测IL-12 p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的转录水平。结果显示结核病阳性牛的外周血淋巴细胞经PPDB和CE刺激后,其IP-10的m RNA转录水平显著高于结核病阴性牛,且与IFN-γ的m RNA转录水平具有良好的相关性;初步建立牛结核病IFN-γ和IP-10的Real-time PCR检测方法,其对临床阳性样本的检出率分别为71.45%和78.57%。因此,IP-10的m RNA转录水平与牛分枝杆菌的感染相关,有作为牛结核病诊断标志物的潜力。     

牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价

为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。     

细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素(PPD-B)、禽结核菌素(PPD-A)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、pET-32a载体标签蛋白(PET)或PBS 37℃培养6h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛(P0.05),其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好(spearman r=0.79),并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ(71.4%)。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B、CE)诱导的IL-17mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

基于iTRAQ定量蛋白质组学技术的不同感染状态结核病牛血清蛋白质组学分析

为了探明不同感染状态结核病牛血清蛋白质水平的差异,揭示结核病牛在不同感染状态下的生理状态.本研究通过皮内变态反应、IFN-γ释放试验从临床筛选结核病阳性牛(TB)和阴性牛(NC),根据牛鼻拭子巢式PCR检测结果将临床阳性牛(TB)分为PCR阳性结核病牛(TBP)和PCR阴性结核病牛(TBN),每组20头,采集血清.应用...     

11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价

为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH),而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异(P0.05)。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛(P0.05)。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。     

细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17 mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素（PPD-B）、禽结核菌素（PPD-A）、重组蛋白CFP-10-ESAT-6（CE）、pET-32a载体标签蛋白（PET）或PBS 37℃培养6 h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛（P<0.05）,其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好（spearman r=0.79）,并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ（71.4%）。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原（PPD-B、CE）诱导的IL-17 mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P>0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P<0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

非洲猪瘟病毒MGF360-14L靶向MAVS抑制Ⅰ型干扰素的产生

本研究旨在探究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）多基因家族成员MGF360-14L对Ⅰ型干扰素（IFN）的抑制作用及其作用机制。通过双荧光素酶试验检测MGF360-14L对线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）诱导的干扰素β（IFN-β）启动子活性的影响,免疫共沉淀和激光共聚焦检测MGF360-14L与MAVS的互作关系,及Western blot分析MGF360-14L对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化的影响。结果表明,ASFV非结构蛋白MGF360-14L抑制MAVS诱导的IFN-β启动子活性。MGF360-14L能够与MAVS互作,并且对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用。此外,当过表达MGF360-14L时,MGF360-14L蛋白与TRIM21竞争结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化作用,从而降低IFN-β的水平。综上所述,MGF360-14L可能通过竞争性结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化,从而下调Ⅰ型IFN的产生。研究结果为探究ASFV的免疫逃逸机制提供了新线索。     

11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价

为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24 h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）,而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异（P>0.05）。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛（P<0.05）。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。